非那西丁和对乙酰氨基酚浓度评估肝脏储备功能*

任 瑞，逯素梅，马永梅，马万山(山东省千佛山医院检验科，济南 250014)



非那西丁和对乙酰氨基酚浓度评估肝脏储备功能*

任 瑞，逯素梅，马永梅，马万山△(山东省千佛山医院检验科，济南 250014)

目的 对非那西丁和对乙酰氨基酚浓度分析进行方法学研究，并进行应用性验证，以评估肝脏储备功能。方法 建立高效液相色谱法(HPLC)测定非那西丁与对乙酰氨基酚浓度，进行标准曲线建立、精密度试验及方法回收率试验，并用健康人血浆进行应用性验证。结果 非那西丁与对乙酰氨基酚在浓度为0.8～40.0 μg/mL的范围内均呈现良好的线性关系。在5、15、25 μg/mL样品浓度下，非那西丁测定的日内精密度分别为0.84%、1.09%和0.53%，日间精密度分别为1.51%、1.10%和1.38%；对乙酰氨基酚测定的日内精密度分别为0.76%、0.89%和0.67%，日间精密度分别为1.02%、1.46%和1.21%，在浓度为1～20 μg/mL浓度范围内，利用所建立的分光光度技术测定，相对标准差(RSD)小于10%，当浓度超过5 μg/mL，RSD<5%。结论 HPLC简便快捷、灵敏度和准确度高，为评估肝脏储备功能提供了一种快捷、准确的方法。

高效液相色谱法； 非那西丁； 对乙酰氨基酚； 肝脏储备功能

肝脏储备功能检测对肝脏类疾病(如肝炎、肝硬化等)的判断极为敏感和重要，但目前肝脏储备功能评价技术和指标如吲哚靛氰绿(ICG)清除试验、影像学检查、13C-美沙西汀呼气试验等存在诸多不足，因此临床迫切需要建立灵敏度高、特异性强的肝脏储备功能评价体系[1]。其中利用探针药物测定肝脏药物代谢酶细胞色素P450(CYP)的活性评价肝脏储备功能备受重视[2]。CYP是生物体内主要的代谢酶，存在种属差异，可参与外源性(药物、前毒物、前致癌物等)及内源性物质(胆固醇、脂肪酸等)的生物转化，其同工酶CYP1A2是CYP酶系的重要家族之一，在人的肝脏呈组成型表达，可参与许多药物、毒物和自身活性物质的代谢，是临床评价肝脏储备功能的理想靶点[3-8]。研究表明，非那西丁是CYP1A2酶活性的特异性底物，在肝脏经O-脱乙基化生成对乙酰氨基酚(图1)[9-10]。通过测定血液中非那西丁及对乙酰氨基酚浓度用以反映CYP1A2活性及药物之间的相互作用，是临床评价CYP1A2 活性的理想方法[11-12]。本研究建立的方法简便快捷、灵敏度和准确度高，为非那西丁试验研究肝脏CYP1A2 在体内的药物代谢活性提供了一种准确、快捷的方式。

图1 非那西丁在肝脏的O-脱乙基反应

1 资料与方法

1.1 一般资料 健康成年人新鲜外周血。

1.2 试剂与仪器

1.2.1 试剂 非那西丁(AR，Sigma公司)；对乙酰氨基酚(AR，Sigma公司)；高锰酸钾(AR，国药集团化学试剂公司)；重铬酸钾(AR，国药集团化学试剂公司)；甲醇(色谱纯，Merk公司)。

1.2.2 仪器 Alliance 2695型高效液相色谱仪(2998UV检测器)(美国Waters公司)；Pico型微量台式离心机(美国Thermo Fisher Scientific 公司)；Stratos高速离心机(美国Thermo Fisher Scientific 公司)；TW12型恒温水浴槽(德国Julabo公司)；Xbridge C18色谱柱(美国Waters公司)。

1.3 标准溶液配制

1.3.1 非那西丁标准溶液配制 准确称取非那西丁对照品80.0 mg，移入100 mL容量瓶中，用甲醇∶水(45∶55)溶解并稀释至刻度,浓度为0.8 mg/mL，置于冰箱中保存。

1.3.2 对乙酰氨基酚标准溶液配制 准确称取对乙酰氨基酚对照品80.0 mg，移入100 mL容量瓶中，用甲醇∶水(45∶55)溶解并稀释至刻度，浓度为0.8 mg/mL，置于冰箱中保存。

1.3.3 色谱条件 分析柱是Waters Xbridge C18色谱柱(250 mm×416 mm,5 μm)；流动相为甲醇∶水(45∶55)；流速为1.0 mL/min；紫外检测波长254 nm；柱温为室温；灵敏度是0102AU FS。

1.3.4 标准曲线制备 按照上述色谱条件分别分析非那西丁标准溶液(0.8 mg/mL)和对乙酰氨基酚标准溶液(0.8 mg/mL)，结果表明2份组分在流动相为甲醇∶水(45∶55)条件下能得到完全分离。准确取非那西丁标准溶液(0.8 mg/mL)和对乙酰氨基酚标准溶液(0.8 mg/mL)各5 mL,混合，移入100 mL容量瓶中并定容，所得溶液非那西丁和对乙酰氨基酚浓度均为40 μg/mL，然后依次配制32、24、16、8、7.2、6.4、5.6、4.8、4.0、3.2、2.4、1.6、0.8 μg/mL系列浓度的溶液，利用自动进样器依次进样，进样量10 μL，采集谱图，记录保留时间。分别以对非那西丁和对乙酰氨基酚的峰高对相应浓度进行线性回归，得回归方程。

1.3.5 精密度试验 按上述方法配制含非那西丁和对乙酰氨基酚浓度为5、15、25 μg/mL的样品，分别按样品浓度测定方法测定日内、日间精密度。

1.3.6 方法回收率试验 取健康人血浆，配制不同浓度的非那西丁和对乙酰氨基酚混合溶液，测定浓度与实际浓度之比即为方法回收率。

2 结 果

2.1 标准曲线建立 采用高效液相色谱法(HPLC)分析，图2所示，非那西丁与对乙酰氨基酚得到很好的分离，二者保留时间分别为7.67 min和3.03 min。采集系列不同浓度下非那西丁的HPLC色谱图，记录保留时间和峰面积。以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标做非那西丁标准曲线(图3)，回归方程为：峰面积=36 816×(浓度)-36 146(r=0.999 9)。进样量10 μL情况下，在浓度为0.8～40.0 μg/mL范围内均呈现良好的线性关系。对乙酰氨基酚标准品在不同浓度下标准曲线(图4)，回归方程为：峰面积=36 352×(浓度)-34 785(r=0.999 9)。进样量10 μL情况下，在浓度0.8～40.0 μg/mL范围内均呈现良好的线性关系。

图2 非那西丁与对乙酰氨基酚HPLC色谱图

图3 非那西丁标准品浓度-HPLC峰面积标准曲线

图4 对乙酰氨基酚标准品浓度-HPLC峰面积标准曲线

2.2 精密度试验 按上述方法配制含非那西丁和对乙酰氨基酚浓度为5、15、25 μg/mL的样品，分别按样品浓度测定方法测定日内、日间精密度，结果见表1。

表1 非那西丁、对乙酰氨基酚精密度试验结果(%,n=6)

2.3 方法回收率试验 取健康人血浆，配制不同浓度的非那西丁和对乙酰氨基酚混合溶液，利用建立的HPLC测定回收率见表2。在浓度为1～20 μg/mL范围内利用所建立的HPLC进行测定，精密度均小5.00%，测定准确，重复性好。

表2 HPLC技术测定回收率

注：PHN为对氨基苯乙醚，PRL为对氨基苯酚。

3 讨 论

非那西丁在CYP1A2酶催化下经O-脱乙基化生成对乙酰氨基酚，通过测定血液中非那西丁及对乙酰氨基酚浓度可评估肝脏储备功能状态。CYP1A2酶是各种因素导致肝脏疾病的共同易损靶点，因此，其特异性底物非那西丁是临床评估肝脏储备功能的一种理想探针药物[13]。非那西丁有本身肝外代谢极少；检测终产物体现了生物转化的连续性；受胃肠吸收、肾脏排泄功能的影响小；对人体影响小、测定简便、价格低廉等优点[14]。

一般而言，服用安全剂量范围内的非那西丁一定时间后，受药物生物利用度和稀释效应等因素的影响，血液中的非那西丁和对乙酰氨基酚浓度均为微克级，需借助HPLC、液相色谱-串联质谱法等现代仪器分析技术才能准确测定血液中药物及代谢产物水平与比值。

本研究建立HPLC测定非那西丁和对乙酰氨基酚浓度用于肝脏储备功能的评估，避免了杂质的干扰，缩短了分析时间，提高了灵敏度和特异度。HPLC作为一种高效、快速的分离、分析技术，以其灵敏度高、选择性好，可分析微量组成甚至衡量样品等特点，成为医药分析领域应用最广、发展最快的现代分析技术之一[15]。

采用HPLC测定，非那西丁和对乙酰氨基酚能够得到良好的分离度和线性关系，且简便快捷、灵敏度和准确度高，为研究CYP1A2在体内的药物代谢活性、评估肝脏储备功能提供了一种快捷、准确的方法。

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Concentrations of phenacetin and paracetamol for assessing liver reserve function*

RENRui,LUSu-mei,MAYong-mei,MAWan-shan△

(DepartmentofClinicalLaboratory,QianfoshanHospital,Jinan,Shandong250014,China)

Objective To perform the methodological study on detecting the levels of phenacetin and paracetamol and to conduct the application verification for assessing the liver reserve function.Methods The high performance liquid chromatography (HPLC) method for detecting the levels of phenacetin and paracetamol was established.The standard curve was established.The precision and recovery tests were performed and the healthy plasma was adopted for conducting the application verification.Results Both phenacetin and paracetamol showed a good linear relationship in the concentration range of 0.8-40 μg/mL.The within-day precisions of phenacetin under 5,15,25 μg/mL samples were 0.84%,1.09% and 0.53% respectively,which of paracetamol were 0.76%,0.89% and 0.67%,respectively.The inter-day precisions of phenacetin under 5,15,25 μg/mL samples were1.51%,1.10% and 1.38%,which of paracetamol were 1.02%,1.46% and 1.21%,respectively.RSD based on established spectrophotometric techniques is less than 10% in the range of 1-20 μg/mL Further,It is less than 5% when the concentration is more than 5 μg/mL.Conclusion The HPLC method is simple,fast,highly sensitive and highly accurate.It provides a fast and accurate method for assessing the liver reserve function.

HPLC method; phenacetin; paracetamol; liver reserve function

山东省科技攻关项目(2009GG10002005)；山东省医药卫生科研项目(2007HW116)。

任瑞，女，本科，在读硕士，主要从事临床检验诊断学。

△通讯作者，E-mail：mwsqianyi@163.com。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.09.011

A

1672-9455(2015)09-1205-03

2014-11-19

2015-01-19)