耐喹诺酮类药物铜绿假单胞菌的质粒基因研究*

刘鲜花，罗史科，祝玲玲，吕东月(.广东省深圳市盐田区人民医院检验科 5808；.广州医科大学附属深圳沙井医院检验科，广东深圳 5804)



耐喹诺酮类药物铜绿假单胞菌的质粒基因研究*

刘鲜花1，罗史科1，祝玲玲1，吕东月2(1.广东省深圳市盐田区人民医院检验科 518081；2.广州医科大学附属深圳沙井医院检验科，广东深圳 518104)

目的 研究耐喹诺酮类药物铜绿假单胞菌(PA)的质粒基因，并分析其耐药机制。方法 临床分离的耐喹诺酮类药物的PA 100株，采用PCR法检测质粒介导的喹诺酮类耐药基因qnrA、qnrB、qnrC、qnrD、qnrS、qepA、aac(6′)-Ib-cr，并对阳性结果进行测序分析。结果 100株PA中检测出含有qnrA基因的菌株34株(34%)；qnrB基因79株(79%)；qnrD基因14株(14%)；qnrS基因8株(8%)；aac(6′)-Ib-cr基因55株(55%)；未检测出qnrC和qepA基因的菌株。结论 质粒携带的qnrA、qnrB/aac(6′)-Ib-cr耐药基因是PA耐喹诺酮类药物的主要机制。

喹诺酮类药物； 铜绿假单胞菌； 质粒； 基因

喹诺酮类药物是临床上常用的抑制细菌DNA旋转酶的抗菌药物，铜绿假单胞菌(PA)是一种最常见的引起医院感染的革兰阴性杆菌[1]。随着喹诺酮类药物在临床上的广泛应用，PA耐药株不断增加，造成临床对其感染治疗和控制变得困难[2]。PA对喹诺酮类药物的耐药机制复杂，其中质粒介导的喹诺酮类耐药(PMQR)包括qnr、qepA、oqxAB、aac(6′)-Ib-cr，其耐药新机制近年来倍受关注[3-5]。现对100株PA进行检测，探讨耐药机制。报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 该院自2012年2月至2014年6月门诊及住院患者的100株耐喹诺酮类药物的PA，-80 ℃冻存备用。菌株分离自痰液、分泌物、血液、胸水和脓液等，剔除同一患者来源的重复菌株。质控菌株为铜绿假单胞菌ATCC 27853和大肠埃希菌ATCC 25922，均购自卫生部临床检验中心。

1.2 仪器与试剂 EPS3501XL电泳仪，美国Pharmacia公司；5810R型高速离心机，德国Eppendorf公司；PCR扩增仪，美国MJ Research公司；310基因分析仪，美国应用生物系统公司；FUSION Fx7凝胶成像系统，法国VILBER公司；细菌DNA提取试剂盒、PCR产物纯化试剂盒均购自上海英骏生物技术有限公司。

1.3 检测方法

1.3.1 DNA提取 从血琼脂平板上选取单个菌落，接种于LB液体培养基中，置37 ℃，190 r/min，振荡孵育过夜。吸取1 mL菌液于离心管内，12 000 r/min，离心5 min，去除上清液。加入PBS 1 mL，吹打沉淀细菌后，12 000 r/min，离心5 min，弃上清液。再加入超纯水500 μL，吹打混匀后置于100 ℃沸水浴5 min，12 000 r/min，离心5 min，获取上清液即DNA提取液分装于离心管中，于-20 ℃保存备用。

1.3.2 PCR引物的设计与合成 采用PCR检测的qnrA、qnrB、qnrC、qnrD、qnrS、qepA、aac(6′)-Ib-cr基因引物均由上海英骏生物技术有限公司合成。见表1。

1.3.3 PCR扩增及产物电泳 引物各0.5 μmol/L，dNTPs各200 μmol/L，加入Taq DNA聚合酶2.5 U，MgCl22 mmol/L，模板液5 μL，总体积20 μL。PCR反应热循环参数：(1)qnrB、qnrD、qnrS、qepA基因：95 ℃预变性2 min；95 ℃ 50 s，53 ℃ 45 s，72 ℃ 60 s，共35个循环，72 ℃延长至2 min。(2)qnrA、qnrC、aac(6′)-Ib-cr基因：95 ℃预变性5 min；95 ℃ 45 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，35个循环；72 ℃延长至5 min。PCR产物10 μL与2 μL上样缓冲液混匀加入2%琼脂糖凝胶，110 V电泳30 min后置入凝胶成像仪中观察并记录结果。

1.3.4 核酸序列分析 扩增后的基因PCR产物经纯化后，送深圳华大基因生物技术有限公司进行序列测定，检测结果使用DNAStar软件进行校正并与GenBank核酸(www.ncbi.nlm.nih.gov)数据库进行比对分析。

2 结 果

2.1 质粒介导的PMQR基因扩增产物 利用PCR方法检测质粒介导的PMQR基因qnrA、qnrB、qnrC、qnrD、qnrS、qepA、aac(6′)-Ib-cr，扩增产物大小分别为516 bp、469 bp、447 bp、664 bp、417 bp、596 bp、482 bp。见图1。

表1 PCR引物序列

注：M表示标记物；1表示qnrS；2表示qnrB；3表示aac(6′)-Ib-cr；4表示qnrC；5表示qnrA；6表示qepA；7表示qnrD。

2.2 质粒介导的PMQR基因检测结果 100株耐喹诺酮类药物(环丙沙星)的PA中检测出含有qnrA基因的菌株34株(34%)；qnrB基因79株(79%)；qnrD基因14株(14%)；qnrS基因8株(8%)；aac(6′)-Ib-cr基因55株(55%)；未检测出含qnrC和qepA基因的菌株。见表2。

表2 100株质粒介导的PMQR基因检测结果

注：-表示无数据。

3 讨 论

抗菌药物大量、长期使用，致使细菌耐药性增强，已经成为感染性疾病治疗的一大难题。PA广泛存在于机体的皮肤和呼吸道等，是临床上最常见的条件致病菌，引起肺炎、泌尿感染、败血症等疾病[6]。喹诺酮类药物通过抑制细菌的拓扑异构酶，阻断DNA复制从而达到抗菌作用，环丙沙星是临床治疗PA最有效的药物之一，但随着其广泛使用，耐环丙沙星的PA已经达到40%以上，严重影响临床治疗效果[7-8]。

PA对喹诺酮类药物产生耐药性的主要途径：(1)主动外排和膜屏障，导致药物无法达到作用靶点，使得其对多种抗菌药物获得耐药。(2)细菌编码的喹诺酮类药物的Ⅳ类拓扑异构酶和DNA旋转酶的基因突变，致使药物不能与酶-DNA复合物稳定结合导致抗菌作用无效。(3)细菌生物膜的形成，其有极强的抵抗作用和耐药性，感染了细菌生物膜的组织即使治疗药物的剂量加倍也难以治愈[9]。染色体介导和质粒介导是PA对喹诺酮类药物耐药的主要机制。pMG252是最早报道的质粒，可使细菌对喹诺酮类药物的耐药水平提高，Martinez等将该质粒命名为qar(quinolone resistance)，后改为qnrA1。此后又发现了qnrB、qnrC、qnrD、qnrS 4种基因亚基。aac(6′)-Ib-cr最早分离于大肠埃希菌中，是一类编码氨基糖苷乙酰基转移酶而使得细菌对氨基糖苷类抗菌药物耐药的基因。aac(6′)-Ib-crr其编码蛋白发生Trp 102-Arg、Asp179-Tyr突变而产生介导环丙沙星耐药的新特性而命名，其主要对环丙沙星哌嗪环上氨基乙酰化作用而介导低水平耐药[10]。

目前有关喹诺酮类抗菌药物的机制研究，大多数学者认为是拓扑异构酶的基因退变而导致细菌耐药，对质粒的作用仅表现低水平耐药。PMQR基因的研究大部分是肠杆菌(如肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌)，有PA的研究非常少。本研究从100株耐喹诺酮类药物(环丙沙星)的PA中未检测出qnrC和qepA基因，检出含有qnrA、qnrB、qnrD、qnrS/aac(6′)-Ib-cr基因的菌株,阳性率分别为34%、79%、14%、8%、55%，其中qnrA、qnrB、aac(6′)-Ib-cr具有较高的携带率，表明其在耐药机制中发挥重要的作用。

[1]明德松，邓勇.国内铜绿假单胞茵对喹诺酮类药物耐药机制的Meta分析[J].中国循证医学杂志，2013,13(10):1215-1218.

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[3]陈树林,陈利达,陈茶，等.铜绿假单胞菌对喹诺酮类药物耐药的分子机制研究[J].中国卫生检验杂志，2012，24(8):899-904.

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[5]贺婷,江涛.铜绿假单胞菌耐药相关基因研究进展[J].国际呼吸杂志，2013,33(5)：393-396.

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[10]蒋岗，徐霖，关琳琳，等.铜绿假单胞菌中质粒介导喹诺酮类耐药基因的研究[J].热带医学杂志，2013,13(7):813-816.

Study of plasmid-mediated quinolones antibacterial in pseudomonas aeruginosa*

LIUXian-hua1,LUOShi-ke1,ZHULing-ling1,LUDong-yue2

(1.DepartmentofClinicalLaboratory,YantianHospital,Shenzhen,Guangdong518081,China;2.DepartmentofClinicalLaboratory,ShajingAffiliatedHospitalofGuangzhouMedical,Shenzhen,Guangdong518104,China)

Objective To study the quinolones resistance plasmid genes in pseudomonas aeruginosa and analyze its mechanism.Methods pseudomonas aeruginosa samples were collected for the detection of qnrA,qnrB,qnrC,qnrD,qnrS,qepA and aac(6′)-Ib-cr gene using PCR,then the positive samples were detected by sequence analysis.Results qnrC and qepA gene were not detected in strains resistance to Ciprofloxacin.the positive rate of qnrA,qnrB,qnrD,qnrS,aac(6′)-Ib-cr gene is 34%,79%,14%,8%,55% respectively.Conclusion plasmid with qnrA,qnrB,aac(6′)-Ib-cr gene is the main mechanism in pseudomonas aeruginosa to quinolones antibacterial.

quinolones antibacterial; pseudomonas aeruginosa; plasmid; gene

深圳市盐田区科技计划资助项目(201211)。

刘鲜花，女，本科，主管技师，主要从事微生物检验研究。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.11.014

A

1672-9455(2015)11-1530-02

2014-12-25

2015-02-12)