miR-34c对胶质瘤细胞增殖、凋亡和细胞周期影响的实验性研究

武震东，任洪波，孙志强，刘 斌，牛国栋，焦保华

（1.河北医科大学第二医院神经外科，河北 石家庄050000；2.河北省邯郸市中心医院神经外科，河北 邯郸056000）

微小RNA（microRNA，miRNA）是一种约22个核苷酸长度非编码单链小RNA，其本身不具有翻译蛋白质的功能，通过与mRNA的3′端非翻译区（3′UTR）碱基序列互补配对在转录后水平调控靶基因表达。miRNA与mRNA能进行完全或近乎完全的互补配对，诱导对mRNA的切割降解，而部分碱基配对则导致功能蛋白质的转录抑制［1］。最近有报道miRNA与肿瘤恶性程度及肿瘤患者的预后有密切关系［2］。亦有报道与正常组织比较，恶性肿瘤组 织 的 miRNA 异 常 表 达［3］。MicroRNA-34c（miR-34c）在胶质瘤组织中广泛低表达，且随胶质瘤级别的升高，miR-34c-3p和miR-34c-5p的表达显著降低，miR-34c-3p和miR-34c-5p表达与胶质瘤级别呈负相关。本研究为胶质瘤细胞系U251和U87细胞转染miR-34c-3p和miR-34c-5p，上调其表达，检测miR-34c对人脑胶质瘤细胞增殖、细胞周期、凋亡等生物学特性的影响，旨在为胶质瘤的治疗开拓新的思路。

1 材料与方法

1.1 细胞株 胶质瘤细胞系U251和U87细胞购于中国科学院细胞库。正常人胶质细胞系HEB细胞购自中国科学院广州生物医药与健康研究院。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养 U251用含10%胎牛血清（fetal calf serum，FBS）的 DMEM-F12培养基，U87和HEB用含10%FBS的DMEM-高糖培养基培养，将符合细胞计数要求的细胞悬液分装入培养瓶内，将培养瓶放入37℃和5%CO2的培养箱内24～48h后换液继续培养，换液的时间由细胞贴壁情况而定。培养U251、U87、HEB细胞达到指数生长期进行实验。利用脂质体介导的转染方法，将化学合成的miR-34c寡核苷酸转染到胶质瘤U87和U251细胞中，同时设立转染非特异性寡核苷酸片段的阴性对照组，使miR-34c基因有效的过表达。将未转染任何核苷酸链的胶质瘤U87和U251细胞为空白组。

1.2.2 细胞转染miRNA 转染采用脂质体转染试剂LipofectamineTMRNAiMAX转染试剂，用LipofectamineTMRNAiMAX转染miRNA（化学合成的成熟miRNA模拟物mimics浓度为50nmol／L）到细胞内，转染时使用Opti-MEM培养基，转染后4h换为细胞生长培养基（U251用含10%FBS的DMEM-F12培养基，U87和HEB用含10%FBS的DMEM-高糖培养基）。

1.2.3 定量PCR检测转染效果 利用RNA抽提试剂Trizol（Invitrogen，USA）提取收集细胞总RNA。取1μg总RNA做茎环引物的逆转录反应。miR-34c-3p和miR-34c-5p的共同逆转录引物为miRNA R：5′CTCAACTGGTGTCGTGGA。PCR引物为 hsa-miR-34c-3p F：5′ACACTCCAGCTGGGAATCACTAACCACACGG；hsa-miR-34c-5p F：5′ACACTCCAGCTGGGAGGCAGTGTAGTTAGCTGAT。内参U6的引物为U6-F：5′CTCGCTTCGGCAGCACA；U6-R：5′AACGCTTCACG-AATTTGCGT。所有引物均为上海生工生物工程公司合成。使用的定量PCR仪为ABI PRISM®7500Sequence Detection System。PCR扩增程序如下：95℃变形5min，随后95℃作用15s，65℃作用15s，72℃作用32s，共进行40个循环，在温度60～95℃进行融解曲线分析，每个样本重复3次。

1.2.4 细胞增殖-毒性检测（Cell Counting Kit-8，CCK-8）法检测细胞增殖能力 取转染后细胞进行下面实验。吹打散细胞，调整细胞浓度为1×105个／mL，分到96孔板，每孔100μL，即每孔细胞为1×104个。等细胞半贴壁完全，收集各个时间点的细胞24、48、72、96h加入CCK-8溶液细胞增殖检测试剂，比例为1∶10。即100μL培养液加入10μL检测液。在孵育4h后，酶标仪读板光密度（optical delnsity，OD）490数据。细胞存活率＝OD转染组／OD对照组。

1.2.5 细胞周期检测 细胞转染48h后每样收集1×106细胞。离心收集细胞，弃上清，用预冷PBS洗细胞2次，加入预冷70%乙醇，于4℃固定过夜，或-20℃长期固定。离心收集细胞，以1mL的PBS洗细胞1次，加入500μL PBS含50μg／mL溴化丙锭（propidiumiodide，PI），100μg／mL核糖核酸酶A（Ribonuclease A，RNase A），0.2%聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100），4℃避光孵育30min。以标准程序用流式细胞仪检测，一般计数2～3万个细胞，结果用细胞周期拟和软件ModFit分析。

1.2.6 细胞凋亡检测 细胞转染48h后，将细胞培养板中各组细胞的培养基分别转移到15mL的锥形管中并置于冰上。用2mL PBS溶液轻轻润洗培养板内细胞，去除PBS溶液，加入0.5mL 0.25%不含EDTA的胰酶孵育，直到显微镜下观察到细胞开始从培养板壁脱落。轻轻连续拍打使细胞从培养板壁上完全脱落，将细胞轻轻重悬于预冷的1×结合缓冲液中使得其密度为1×106细胞／mL，将0.5 mL细胞悬液从细胞培养板中（5×105个细胞）转移到1个干净的离心管内，加入1.25μL细胞凋亡检测试剂Annexin V-FITC，室温（18～24℃）避光反应15min，室温1 000g离心5min，去除上清，将细胞用0.5mL预冷的1×结合缓冲液轻轻重悬，加入10μL PI，立即用流式细胞仪检测分析。

1.3 统计学方法 应用SPSS 16.0统计学软件进行数据分析。计量资料以±s表示，分别采用单因素方差分析、LSD-t检验和重复测量设计资料的方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 定量PCR检测miR-34c-3p和miR-34c-5p的转染效果 在U87和U251细胞系中，miR-34c-3p和miR-34c-5p的表达量要明显小于正常胶质细胞系HEB（图1，2）。而转染了 miR-34c-3p或 miR-34c-5p的U87和U251细胞，其miR-34c-3p的表达量明显高于空白组（P＜0.05，图1）和阴性对照（P＜0.05）。该结果确定了miRNA确实转染成功。

2.2 转染miR-34c抑制胶质瘤细胞的增殖能力在U251细胞中，转染miR-34c-3p或miR-34c-5p后48、72、96h，细胞存活率显著低于空白组（P＜0.05）和阴性对照组（P＜0.05）（图3）。而在 U87细胞中情况有所不同，转染miR-34c-3p后48、72、96h，细胞存活率显著低于空白组（P＜0.05）和阴性对照组（P＜0.05）；转染 miR-34c-5p后24、48、72、96h，细胞存活率显著低于空白组（P＜0.05），而与阴性对照组差异无统计学意义（P＞0.05）（图4）。

2.3 转染miRNA-34c后细胞周期的变化 在U251细胞中，空白组和阴性对照组细胞的G0／G1期分别占72.7%和73.44%，而转染miR-34c-3p或miR-34c-5p后，其 G0／G1期分别降至44.24%和43.58%。而空白组和阴性对照组细胞的G2／M期分别仅占4.4%和4.31%，转染miR-34c-3p或miR-34c-5p后，其G2／M期分别升至21.6%和21.83%。S期与G2／M期相似，转染后所占比例上升（图5）。在U87细胞中，空白组和阴性对照组细胞的G0／G1期分别占69.3%和75.62%，转染miR-34c-3p后，其G0／G1期降至44.05%，而转染miR-34c-5p却不能影响G0／G1期（79.07%）。空白组和阴性对照组细胞的S期分别占20.66%和13.61%，转染miR-34c-3p后，其S期升至48.83%，但转染miR-34c-5p同样不能影响S期（11.04%）。G2／M期在4组中所占比例差异无统计学意义（图5）。该实验证实了U251细胞高表达miR-34c-3p或miR-34c-5p，U87细胞高表达miR-34c-3p可以导致细胞停滞在S期，同时降低了G0／G1期的细胞数。细胞周期的变化说明miR-34c可能通过抑制细胞周期中的某个通路以达到抑制细胞增殖的目的。

2.4 转染miRNA-34c后诱导胶质瘤细胞的凋亡

根据流式细胞仪的结果，Annexin V和PI双阳性的细胞即为凋亡细胞。在U251细胞中，凋亡细胞在空白组和阴性对照组分别占6.57%和6.3%，而转染miR-34c-3p或miR-34c-5p后凋亡细胞所占比例上升分别占28.49%和28.14%。但是在U87细胞中有所不同，仅转染miR-34c-3p后凋亡细胞数上升（3.56%），而空白组，阴性对照组和转染miR-34c-5p组分别为1.53%，1.68%和1.91%（图6）。

图1 实时定量PCR检测正常胶质细胞系HEB、U251和U87细胞系中miR-34c-3p的表达＊P＜0.05为miR-34c-3p组与空白组比较 ＃P＜0.05为miR-34c-3p组与阴性对照组比较 △P＜0.05为空白组与HEB比较（LSD-t检验）

图2 实时定量PCR检测正常胶质细胞系HEB、U251和U87细胞系中miR-34c-5p的表达＊P＜0.05为miR-34c-5p组与空白组比较 ＃P＜0.05为miR-34c-5p组与阴性对照组比较 △P＜0.05为空白组与HEB比较（LSD-t检验）

图3 转染miR-34c-3p或miR-34c-5p后，U251细胞的生存率＊P＜0.05为转染组与空白组比较 ＃P＜0.05为转染组与阴性对照组比较（重复测量设计资料的方差分析）

图4 转染miR-34c-3p或miR-34c-5p后，U87细胞的生存率＊P＜0.05为转染组与空白组比较 ＃P＜0.05为转染组与阴性对照组比较（重复测量设计资料的方差分析）

图5 转染miRNA-34c-3p或miR-34c-5p后，细胞的细胞周期情况A.U251细胞；B.U87细胞

图6 转染miR-34c-3p或miR-34c-5p后，细胞的凋亡情况A.U251细胞；B.U87细胞

3 讨 论

肿瘤的发生是细胞增殖、凋亡和分化失衡的结果。越来越多的研究证实许多miRNA具有促进细胞增殖和存活的作用，同时还有许多miRNA具有抑制细胞增殖和存活的作用，这两类miRNA作为癌基因和抑癌基因在肿瘤的发生发展过程中发挥着重要的作用［4-5］。说明将miRNA作为肿瘤治疗的靶标是可行的。在近期的研究中，miR-34异常表达抑制细胞分化、克隆形成，使细胞周期阻滞在G1期［6-7］。并且，miR-34a的再表达诱导了细胞的凋亡［8］。miR-34介导的细胞凋亡能够被p53基因的失活所抑制。miR-34a靶向一些mRNA，如SIRT1（Sirtuin type 1）、Bcl-2（B-cell lymphoma-2）、N-myc、细胞周期蛋白D1（cyclin D1），抑制这些基因转录［6，9-10］。最近有报道，miR-34c能够抑制血管平滑肌细胞的增殖［11］。

恶性胶质瘤是神经系统常见的肿瘤。miR-34c在人类恶性胶质瘤组织和多种细胞系中低表达。本研究利用多种细胞生物学方法，进一步探讨miR-34c对胶质瘤U87和U251细胞系的生物学功能，以便为胶质瘤的治疗寻找新的靶标。本研究首先检测转基因细胞对胶质瘤细胞增殖的影响，利用经典的CCK-8实验对细胞进行检测，结果显示转染了miR-34c-3p或miR-34c-5p的细胞能够明显减弱细胞的增殖，但U87细胞中miR-34c-5p与其阴性对照组比较差异无统计学意义，也就是说miR-34c-5p的抑制增殖作用比较弱，猜测在U87细胞中miR-34c-5p对细胞的抑制机制可能与miR-34c-3p有所不同。细胞周期是指一个母细胞分裂形成的细胞到下一次再分裂形成2个子细胞的时期，分为间期（G1、S、G2期）和有丝分裂期（M 期）。本研究采用流式细胞仪分析转染miR-34c-3p或miR-34c-5p后细胞周期的变化，发现转染后的U251细胞多停滞在S期及G2／M期，而仅转染了miR-34c-3p的U87细胞多停滞在S期，转染了miR-34c-5p的U87细胞周期变化与空白组和阴性对照组差异无统计学意义，表明miR-34c-5p抑制U87细胞的机制与miR-34c-3p不同，这也进一步佐证了细胞增殖能力的结果。凋亡细胞对所有用于细胞活性鉴定的染料，如PI有抗染性，细胞膜有损伤的细胞的DNA可被PI着染产生红色荧光，而细胞膜保持完好的细胞则不会有红色荧光产生。本研究结果显示，转染miR-34c-3p或miR-34c-5p的U251细胞的凋亡率明显增高，而转染miR-34c-3p或miR-34c-5p的U87细胞凋亡率变化不大。

从体外实验数据看出，miR-34c-3p和miR-34c-5p能够抑制胶质瘤细胞增殖，导致细胞周期停滞在S期及G2／M期，诱导胶质瘤细胞的凋亡，大胆推测miR-34c-3p和miR-34c-5p在胶质瘤中扮演抑癌的角色，但miR-34c-3p与miR-34c-5p在不同细胞系中，影响细胞增殖能力、细胞周期变化及诱导细胞凋亡的效果有所不同，推测它们可能是通过不同靶点或机制起作用，有待于在以后的实验中继续探讨miR-34c-3p和miR-34c-5p在胶质瘤的作用机制。

［1］ Nelson KM，Weiss GJ.MicroRNAs and cancer：past，present，and potential future［J］.Mol Cancer Ther，2008，7（12）：3655-3660.

［2］ Gao H，Zhao H，Xiang W.Expression level of human miR-34a correlates with glioma grade and prognosis［J］.J Neurooncol，2013，113（2）：221-228.

［3］ Croce CM.Causes and consequences of microRNA dysregulation in cancer［J］.Nat Rev Genet，2009，10（10）：704-714.

［4］ Deng S，Calin GA，Croce CM，et al.Mechanisms of microRNA deregulation in human cancer［J］.Cell Cycle，2008，7（17）：2643-2646.

［5］ Medina PP，Slack FJ.microRNAs and cancer：an overview［J］.Cell Cycle，2008，7（16）：2485-2492.

［6］ Bommer GT，Gerin I，Feng Y，et al.p53-mediated activation of miRNA34candidate tumor-suppressor genes［J］.Curr Biol，2007，17（15）：1298-1307.

［7］ Tarasov V，Jung P，Verdoodt B，et al.Differential regulation of microRNAs by p53revealed by massively parallel sequencing：miR-34ais a p53target that induces apoptosis and G1-arrest［J］.Cell Cycle，2007，6（13）：1586-1593.

［8］ Hermeking H.The miR-34family in cancer and apoptosis［J］.Cell Death Differ，2010，17（2）：193-199.

［9］ Yamakuchi M，Ferlito M，Lowenstein CJ.miR-34arepression of SIRT1regulates apoptosis［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2008，105（36）：13421-13426.

［10］ Christoffersen NR，Shalgi R，Frankel LB，et al.p53-independent upregulation of miR-34aduring oncogene-induced senescence represses MYC［J］.Cell Death Differ，2010，17（2）：236-245.

［11］ Choe N，Kwon JS，Kim YS，et al.The microRNA miR-34c inhibits vascular smooth muscle cell proliferation and neointimal hyperplasia by targeting stem cell factor［J］.Cell Signal，2015，27（6）：1056-1065.