α硫辛酸对实验性自身免疫性脑脊髓炎大鼠轴索损伤的保护作用

周 毅，朱一飞，李世平，王 颖，檀红玲，檀国军

（河北医科大学第二医院神经内科，河北 石家庄050000）

多发性硬化（multiple sclerosis，MS）是以中枢神经系统脱髓鞘为主要病理变化的疾病［1］。既往研究认为，中枢神经系统原发性脱髓鞘病变是导致MS患者出现神经功能障碍的主要因素［2］。近年来研究证实，除炎性脱髓鞘病变外，MS发病过程中往往还合并轴索损伤，且轴索损伤程度与MS病情严重程度密切相关［3］。因此，研究 MS轴索损伤机制及其相关轴索损伤保护作用正成为近年的研究热点。α硫辛酸作为强抗氧化剂，可有效抑制机体内脂质过氧化反应，清除活性氧自由基，其对糖尿病周围神经病变患者周围神经的保护功能已得到公认［4-5］。但α硫辛酸对MS轴索损伤的保护作用尚未明确。实验性自身免疫性脑脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE）模型可有效演绎MS的发病过程，是临床研究MS最常用的动物模型。本研究以EAE模型大鼠作为研究对象，分别采用α硫辛酸和地塞米松进行药物干预，观察药物干预对EAE大鼠发病情况和轴索组织病理改变的影响，探讨α硫辛酸对MS轴索损伤的保护作用，旨在为临床MS治疗提供新思路。

1 材料与方法

1.1 试验动物 豚鼠10只，雄性，体质量350～400 g。Wistar大鼠36只，雌性，体质量180～200g，6～8周龄。以上动物均购于河北医科大学第二医院实验动物中心。

1.2 试验试剂及设备 α硫辛酸、地塞米松、完全弗氏佐剂（美国Sigma公司）；高速低温离心机（日本三洋SCR20B型）。

1.3 动物模型建立 取上述豚鼠10只，采用10%水合氯醛（0.5mL／100g）进行静脉麻醉，断颈处死，于低温环境下取出豚鼠脊髓并去除脊髓膜和马尾，称质量并加入等质量的4℃生理盐水，采用匀浆机制备全脊髓匀浆（guinea pig spinal cord homogenate，GPSCH），之后加入等体积完全弗氏佐剂，二者充分混合后制成油包水型抗原乳剂，4℃保存备用。剩余36只Wistar大鼠，取四肢足垫及背部皮下5点为注射部位，分别给大鼠注射上述油包水型抗原乳剂（0.5mL／只），并以此建立EAE动物模型。

1.4 动物干预及分组 待EAE大鼠第1次发病后将EAE大鼠随机分为3组，即EAE组、LA组和DXM组，每组12只。各组自第1天发病起分别给予不同药物进行腹腔注射，LA组给予α硫辛酸（100mg·kg-1·d-1），DXM 组给予地塞米松（2 mg·kg-1·d-1），EAE组给予等体积生理盐水，连续注射7d。

1.5 神经功能检测［6］神经功能评价参照Kono［7］评分标准：仅尾部无力，其余部位正常记1分；尾部、双前肢和（或）双后肢无力记为2分；尾部无力，双前肢或双后肢瘫痪，但被动翻身后仍可复原记为3分；尾部无力，双前肢及双后肢瘫痪，被动翻身后无法复原记为4分；濒死状态或死亡记为5分。

1.6 组织病理学 受试大鼠处死，快速取脊髓腰膨大组织并固定于40g／L多聚甲醛中。PBS缓冲液冲洗标本，常规梯度乙醇溶液进行标本脱水，二甲苯透明，浸蜡，石蜡包埋。采用改良三色染色法进行组织切片染色。

1.7 统计学方法 应用SPSS 18.0统计软件进行数据分析。计量资料以±s表示，组间比较采用单因素方差分析，组内两两比较采用q检验；计数资料以百分率表示，组间比较采用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 实验大鼠第1次发病情况 GPSCH诱导免疫后，大鼠陆续出现精神不振、食欲下降、皮毛杂乱等症状；第12天大鼠第1次发病，主要表现为尾部无力、双前肢和（或）双后肢肌张力下降甚至瘫痪、斜颈、无法抬头等；第14天大鼠进入发病高峰期，临床症状加重，主要表现为四肢麻痹无力（双后肢更甚），多合并大小便失禁和精神症状（易激惹、攻击行为）。

2.2 复发率 LA组和DXM组复发率均明显小于EAE组，组间比较差异有统计学意义（P＜0.05）；LA组与DXM组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 3组大鼠复发率比较Table 1 Recurrence rate in different groups（n＝12，只数，%）

2.3 神经功能缺损评分 发病后7d、14d，LA组和DXM组神经功能缺损评分均明显低于EAE组，差异有统计学意义（P＜0.05）；DXM组神经功能缺损评分低于LA组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 3组大鼠神经功能缺损评分比较Table 2 Neurologic function score in different groups（n＝12，±s，分）

表2 3组大鼠神经功能缺损评分比较Table 2 Neurologic function score in different groups（n＝12，±s，分）

＊P＜0.05与EAE组比较 ＃P＜0.05与LA组比较（q检验）

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2.4 组织病理学 改良Bielschowsky银染色结果显示，正常对照组轴索粗细均匀、走行方向一致、轴索的连续性完好；EAE组出现不同程度轴索改变，可见轴突肿胀、增粗、弯曲，着色不均，呈锯齿状或串珠状，不连续，甚至断裂，髓鞘结构层次紊乱（图1A）；LA组轴索改变较EAE组明显减轻，但仍有少部分轴索肿胀、粗细不均、排列紊乱（图1B）；DXM组轴索改变情况与LA组类似（图1C）。

图1 各组大鼠脊髓轴索组织病理切片（改良Bielschowsky银染色×400）A.EAE组；B.LA组；C.DXM组Figure 1 Expression of spinal cord axon in different groups（improving Bielschowsky staining×400）

3 讨 论

越来越多的证据支持轴索损伤在MS的发生与发展过程中发挥重要作用［6，8］。氢质子磁共振波谱检查显示，即使在损伤不明显的MS患者脑区也出现N-乙酰天门冬氨（N-acetyl aspartate，NAA）／肌酸（creatine，Cr）比值下降现象，而 NAA／Cr比值变化与轴索损伤程度密切相关，提示MS早期即存在轴索损伤现象［9］。

本研究成功建立EAE大鼠模型，观察结果显示，模型大鼠至免疫诱导后第14天（发病期），陆续出现四肢麻痹无力、大小便失禁和精神表现异常等症状；首次发病之后第7天（缓解期）病情相继缓解；首次发病后第14天大部分（复发期）大鼠再次出现肢体瘫痪症状，且此期症状表现比首次发病时更为严重，主要表现为极度消瘦（体质量下降20%～30%）、背部溃疡、口鼻出血等。改良的三色染色法结果显示EAE模型大鼠存在明显轴索损伤现象，且病程各期表现不一，发病期轴索损伤明显，缓解期轴索损伤有所减轻，复发期轴索损伤加重，更甚于首次发病期。本研究结果提示，EAE模型大鼠轴索损伤趋势与其临床病程进展一致，进一步佐证了轴索损伤与MS密切相关。探讨MS轴索损伤保护机制可能是临床治疗MS的新思路。

近年来研究证实，自由基是诱发MS的重要因素［10-11］。由单核细胞产生的氧自由基可介导一系列氧化应激反应，从而导致脱髓鞘和轴突损伤；此外，自由基还可通过激活核转录因子κB，上调肿瘤坏死因子、血管内皮细胞黏附分子1和细胞间黏附分子1的表达，从而促进MS发生和发展。因此，调节机体氧自由基水平可能是治疗MS的可靠途径［12-13］。

α硫辛酸是线粒体脱氢酶的天然辅助因子，可有效清除活性氧自由基，阻断脂质过氧化，从而减少机体氧化应激损伤。其对糖尿病周围神经病变患者周围神经的保护功能已得到公认。本研究显示，采用α硫辛酸进行干预可明显改善EAE模型大鼠神经功能损伤症状；组织病理学结果证实，α硫辛酸可明显改善EAE所致的轴索损伤现象；此外，采用α硫辛酸进行干预可明显降低EAE模型大鼠复发率。分析其原因可能与α硫辛酸对EAE所致的轴索损伤发挥保护作用有关。

综上所述，α硫辛酸对EAE大鼠轴索损伤具有一定保护作用。然而，α硫辛酸对EAE的作用机制尚未完全明确，有待进一步深入研究。

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