抗痛风药SE-10平衡溶解度、表观油水分配系数及解离常数的测定

李 慧，张 起，赵燕芳，刘晓红，张向荣

(沈阳药科大学 药学院，辽宁 沈阳 110016)

抗痛风药SE-10平衡溶解度、表观油水分配系数及解离常数的测定

李 慧，张 起，赵燕芳，刘晓红*，张向荣*

(沈阳药科大学 药学院，辽宁 沈阳 110016)

目的建立SE-10含量测定方法，并测定其理化常数，为其制剂开发提供理论依据。方法采用HPLC法测定SE-10在37 ℃不同pH缓冲溶液中的平衡溶解度及表观油水分配系数；采用紫外吸光度法对SE-10的解离常数进行测定。结果SE-10的平衡溶解度随pH的增加而增加；表观油水分配系数与之相反；pH6.8时，SE-10的平衡溶解度为237.1 μg·mL-1，logP值为1.68；SE-10的pKa值为4.34。结论SE-10为难溶性药物，其具有适宜的解离常数和脂溶性，在肠道很容易被吸收。

药剂学；SE-10；理化常数；平衡溶解度；表观油水分配系数；解离常数

痛风是由于嘌呤代谢紊乱，尿酸产生过多或尿酸排泄量减少，血液中尿酸浓度持续增高导致其在关节、软骨和肾脏中析出形成结晶盐沉淀而引起的组织异物性炎性疾病[1]。有文献显示，痛风与糖尿病、胰岛素抵抗、高血压、高脂血症及心血管疾病等病症相关[2-3]。

Fig.1 Structure of SE-10图1 SE-10的结构

SE-10（图1）化学名为2-（3-氰基-4-异丁氧基苯基）-4-甲基-5-硒唑甲酸），是以非布司他为原型全新合成的一类弱酸性药物[4]。药理学实验证实，SE-10可有效降低高尿酸患者的血尿酸浓度，作用与非布索坦相当。对于弱酸性或弱碱性药物，由于受到胃肠道 pH的影响，药物会以分子型和离子型两种形式存在。根据 pH-分配假说（pH-partition hypothesis），药物的吸收取决于药物的解离状态和油水分配系数，只有分子型的、脂溶性大的药物才能透过细胞膜被人体所吸收。对于口服固体制剂，胃肠道的脂溶性细胞膜为影响药物吸收的主要屏障，若药物的水溶性强而脂溶性差，则不能透过细胞膜被人体吸收；当然，若药物的脂溶性太强，则药物与细胞磷脂膜融合后不易被释放出来也无法被人体吸收。表观油水分配系数是反应药物的脂溶性的重要参数。因此，SE-10理化常数的测定对其制剂的开发具有重要的指导意义。

1 仪器与材料

Waters 2489 UV/Visible Detector和Waters e2695 Separations Module 高效液相色谱仪（沃特世科技(上海)有限公司 ）；Adventure电子分析天平（奥豪斯国际贸易有限公司）；UV-1801型紫外可见分光光度计（北京瑞利分析仪器公司）；XW-80涡旋混合仪（上海精科实业有限公司）；HZQ-C 空气振荡浴 (哈尔滨市东联电子技术开发有限公司)；TGL-16B台式离心机（上海安亭科学仪器厂制造）；LDZ5-2型低速自动平衡离心机（北京医用离心机厂）。

SE 10原料（自制，纯度＞99.1%）；磷酸氢二钾（分析纯，天津博迪化工有限公司）；氢氧化钠（分析纯，天津博迪化工有限公司）；磷酸二氢钾（分析纯，天津博迪化工有限公司）；十二烷基硫酸钠（安徽山河药用辅料股份有限公司）；正辛醇（分析纯，天津市康科德科技贸易有限公司）；无水乙醇（色谱纯，天津市康科德贸易有限公司）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Thermo C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈-0.5g·L-1磷酸水溶液（体积比60 : 40）；检测波长：328 nm；流速：1.0 mL·min-1；柱温：30 ℃；进样量：10 μL。

2.2 方法学考察

2.2.1 专属性

称取SE-10约25 mg，精密称定，置于50 mL量瓶中，乙腈溶解并定容至刻度，制成浓度为501.2 mg·L-1的母液；精密移取1 mL母液至10 mL量瓶中，加入乙腈稀释定容，制成SE-10质量浓度为50 mg·L-1的溶液作为样品溶液；以乙腈作为空白溶剂，按上述色谱条件进行操作，记录色谱图，结果见图2。结果表明，溶剂不干扰原料药的测定，方法专属性好。

Fig.2 Chromatograms of blank solution (A) and SE-10(B)图2 空白溶剂（A）和SE-10（B）色谱图

2.2.2精密度

按“2.2.1”项下样品溶液配制方法制备含SE-10约为50 mg·L-1的溶液，按照“2.1”项下色谱条件，重复进样6针，记录峰面积。结果RSD %= 1.93，系统精密度良好。

称取25 mg 的SE-10原料药6份，精密称定，同法配制成含SE-10为50 mg·L-1的供试品溶液，外标法计算含量。6个样品含量测定结果的RSD%为 0.21，方法精密度良好。

2.2.3 准确度

精密称取SE-10原料药 4、5、6 mg各3份，置于100 mL量瓶中，加入乙腈溶解定容，摇匀，滤过，取续滤液备用，作为供试品溶液；精密称取SE-10对照品适量，同法操作，作为外标对照溶液。精密量取10 μL供试品溶液和外标对照溶液，注入高效液相色谱仪，记录色谱图。按外标法以峰面积计算药物浓度，求回收率。结果见表1。

Table 1 Results of recovery experiments of SE-10表1 SE-10回收率试验

结果显示，回收率RSD%=0.63，方法可准确测定SE-10的含量。

2.2.4 检测限、定量限及标准曲线

精密量取“2.2.1”专属性项下制备的母液1 mL逐级稀释，精密量取稀释样品10 μL注入液相色谱仪，记录测谱图。当信噪比为10时的样品浓度即为定量限，信噪比为3时的样品浓度即为检测限。试验结果表明，建立的含量测定方法的定量限为0.035 mg·L-1，检测限为0.01 mg·L-1。

精密量取“2.2.1”专属性项下制备的母液0.2、0.4、0.8、1.0、1.2、2.0 mL至10 mL量瓶中，加入乙腈稀释定容，制得浓度分别为10.02、20.05、40.10、50.12、60.14、80.19、100.24 mg·L-1的溶液，作为系列标准溶液，以定量下限为系列标准溶液最低点。精密量取标准溶液10 μL注入高效液相色谱仪，记录色谱图。以SE-10的质量浓度ρ（mg·L-1）为横坐标，以色谱峰峰面积A为纵坐标进行线性回归，得回归方程：A=375 90ρ-338 3.8，r=0.999 9。结果表明，在0.035～100.24 mg·L-1的浓度范围内，线性关系良好。

2.2.5 稳定性试验

按“2.2.1”项下样品溶液配制方法制备含SE-10约为50 mg·L-1的溶液，于室温、阳光不直射的条件下放置，于0、2、4、6、8、10、12 h取样，按照“2.1”项下色谱条件，精密量取10 μL注入高效液相色谱仪，记录峰面积。结果显示，12 h内SE-10色谱峰峰面积的RSD%小于2%，表明样品溶液在室温放置12 h内稳定。

2.3 SE-10平衡溶解度的测定[5]

SE-10为难溶性药物，几乎不溶于水，所以测定SE-10在不同pH中的平衡溶解度，可为指导制剂剂型的研发及体外溶出介质的筛选提供依据。

取SE-10原料过量，置于玻璃试管中，分别加入不同pH值的缓冲液（pH 1.2、pH 3.6、pH 4.5、pH 5.8、pH 6.8、pH 7.2），涡旋至药物不再溶解（可酌情添加原料药，确保试管中有未溶的药物存在）。将试管放入空气恒温振荡器中，于37 ˚C 振摇72 h。将饱和SE-10溶液以3500 r·min-1离心10 min，取上层澄清溶液，再以130 00 r·min-1离心10 min，取上层澄清溶液，用乙腈稀释至适宜浓度后，采用高效液相法测定。另取对照溶液，同法测定，按照外标法计算药物在不同溶液中的平衡溶解度。结果见表2。

Table 2 Equilibrium solubility of SE-10 in PBS at different pH (37 ℃)表2 SE-10在不同pH缓冲液中的平衡溶解度

Fig.3 The equilibrium solubility of SE-10 in PBS at different pH图3 SE-10在不同pH缓冲液中平衡溶解度趋势线

2.4 表观油/水分配系数的测定

正辛醇的溶解度参数δ为10.24，与细胞磷脂膜的溶解度参数（δ=10.3）最为接近，最能模拟药物在体内的体液与细胞磷脂分配情况，常被用作有水分配系数测定的油相。试验操作如下。

精密称取SE-10适量，以被水饱和的正辛醇为溶剂，配制成浓度为0.3 mg·mL-1的溶液。精密量取上述SE-10正辛醇溶液0.5 mL作为油相，分别加入已被正辛醇饱和的PBS 1.2、PBS 2.0、PBS 3.6、PBS 4.5、PBS 5.8、PBS 6.8、PBS 7.2的溶液5 mL作为水相，将混合溶液置于37℃空气恒温振荡器内平衡72 h[5-6]，使系统达到萃取平衡。取出样品，于3500 r·min-1离心10 min，精密量取上层油相0.1 mL于5 mL量瓶中，乙腈稀释定容，采用高效液相色谱法测定油相中药物浓度。计算公式如下：

公式中，ρw为SE-10分配平衡时水相中药物浓度（mg·L-1）；ρo和ρ为分别为平衡前后正辛醇层中的药物浓度（mg·L-1）；Vo和Vw分别为平衡体系中正辛醇相和水相的体积（mL）；Po/w为SE-10的表观油/水分配系数。

根据上述公式计算SE-10在各pH值条件下的Po/w值，结果见表3。

Table 3 logP of SE-10 at different pH表3 SE-10在不同pH下的logP值

Fig.4 The apparent oil/water partition coefficient of SE-10 in PBS-octanol system at different pH图4 SE-10在不同pH缓冲液-正辛醇体系中表观油水分配系数趋势线

2.5 解离常数的测定

对于弱酸性或弱碱性药物，由于受到胃肠道 pH的影响，药物会以分子型和离子型两种形式存在。只有分子型、脂溶性大的药物才能透过细胞膜被人体所吸收。根据 pH-分配假说（pH-partition hypothesis），药物的吸收取决于药物的解离状态和油水分配系数。对于 SE-10这种弱酸性药物，其未解离型浓度Cu和解离型Ci存在如下关系，

式中pKa为解离常数（dissociation constant），又叫做电离平衡常数或电离常数，用符号K表示。一种弱电解质的解离常数只与温度有关，而与该电解质的浓度无关。由此可知，pKa可以用来预测药物在不同环境下的存在状态，亦是制剂研发所需要的重要参数。

测定解离常数的方法包括电位滴定法、分光光度法、电导法以及毛细管电泳法。其中分光光度法以操作简单、适用范围广而得到广泛应用。本文采用紫外分光光度法测定SE-10的解离常数。

根据SE-10结构式分析可知，SE-10是一元弱酸类药物。一元弱酸在水中达到电离平衡以后，存在如下关系：

本文作者采用分光光度法测定弱酸的解离常数，其原理基于弱酸药物在强酸性溶液中全部为分子型[HA]，而在强碱性溶液中全部解离为离子型[A-]，因此可以强酸和强碱性缓冲液为溶剂测出药物在特定波长（λ）时的完全分子型和完全离子型的吸光度AM和AI，在其他适宜pH 缓冲液中在相同波长处测出同浓度弱酸溶液的吸收度A为分子型和离子型的混合吸收度，即：

上式中AI为在测定波长下离子型吸收度，AM为在测定波长下分子型吸收度。FI为离子型浓度在总浓度的分数，则：

同理，FM为分子型浓度在总浓度的分数，则：

根据Beer 定律：A = εFcl，则有：

如果每次测量的总浓度相同，则A 可替代ε，则有：

因此可以求出解离常数：

2.5.1 储备液的制备

称取SE-10约5 mg，置于100 mL量瓶中，加入少量无水乙醇超声溶解，冷却至室温，乙醇稀释至刻度。

2.5.2 pKa的测定

精密移取2 mL储备液6份，置于10 mL量瓶中，分别加入0. 1 mol·L-1NaOH 、0. 1 mol·L-1HCl溶液和pH 值约为3.8、4.0、4.3、4.7的磷酸盐缓冲液（精密测定pH）稀释定容，摇匀，测定各容量瓶药液在326 nm处的吸光度（A），计算pKa。结果见表4。

Table 4 The results of dissociation constant determination表4 解离常数测定结果

3 结论

SE-10为弱酸性药物，其平衡溶解度具有pH依赖性，随着pH的增加而增加，但其溶解度仍偏低。SE-10的表观油水分配系数随pH的增大而减小，在不同pH水相测定的表观油水分配系结果表明SE-10具有较好的脂溶性，推测药物容易透过细胞膜被人体吸收。正常小肠pH约为7，通常pKa＞3.0的弱酸性药物和pKa＜7.8的碱性药物很容易吸收，试验测得SE-10的pKa为4.34，综合其脂溶性测定结果，可以预测，SE-10在胃肠道容易被吸收，比较适宜做成口服制剂。这为SE-10的口服制剂开发提供了理论依据。

[1] HAYDEN M R, TYAGI S C. Uric acid: a new look at an old risk marker for cardiovascular disease, metabolism syndrome, and type diabetes mellitus: the urate redox shuttle [J]. Nutr metab (lond), 2004, 1(1):10.

[2] SCHLESINGER N, Jr SCHUMACHER H R. Gout: can management be improved? [J]. Curr Opin Rheumatol, 2001, 13: 240-244.

[3] TERKELTAUB R A. Clinical practice. Gout[J]. N Engl Med, 2003, 349: 1647-1655.

[4] 沈阳药科大学. 一种硒咗甲酸类化合物及其制备方法和用途: CN, 103130744[P]. 2013-06-05.

[5] 张琪, 龚耘, 劳嘉泳,等. 非布索坦平衡溶解度、表观油水分配系数及解离常数的测定[J]. 中国新药杂志, 2013,22(1): 103-106.

[6] ISO Y, IRIE T, IWAKI T, et al. Synthesis and modification of a novel 1-β-methyl carbapenem antibiotic, S-4661[J]. J Antibiok (Tokyo), 1996, 49(5): 478-484.

Determination of equilibrium solubility, apparent oil/water partition coefficient and dissociation constant of antigout drug SE-10

LI Hui, ZHANG Qi, ZHAO Yan-fang, LIU Xiao-hong*, ZHANG Xiang-rong*
(School of pharmacy, Shenyang Pharmaceutical University, Shenyang 110016, China)

objectiveTo establish a method for determination the content of SE-10, determinate its physicochemical constants, and provide theoretical basis for the development of preparations.MethodsHigh performance liquid chromatography method was established to measure equilibrium solubility, apparent oil/water partition coefficient of SE-10 at 37 ℃ in buffer solution at various pH. The pKa was determined by UV method.ResultsThe equilibrium solubility of SE-10 increased with increase in pH, and apparent oil/water partition coefficient decreased inversely. Equilibrium solubility was 237.1μg·mL-1and logP was 1.68 when the pH was 7.0. The pKa calculated by UV absorbance was 4.34.ConclusionsSE-10 is slightly soluble. Appropriate dissociation constant and lipophilicity of SE-10 suggest that it would be absorbed easily by intestine, and this provides the theoretical basis for development of SE-10 oral preparation.

pharmaceutics; SE-10; physicochemical constants; equilibrium solubility; apparent oil/water partition coefficient; dissociation constant

R94

：A

(本篇责任编辑：时硕坤)

（2015）01-0027-08

10.14146/j.cnki.cjp.2015.01.003

2014-04-15

李慧（1988-）, 女（汉族）, 辽宁锦州人, 硕士研究生, E-mail yaojilihui@126.com; *

：刘晓红（1977-）, 女（汉族）, 辽宁沈阳人, 讲师, 主要从事新药研究与开发, Tel. 024-23986325, E-mail LVJ221@163.com;张向荣（1969-）, 女（汉族）, 辽宁辽阳人, 副教授, 主要从事药物动力学研究, Tel. 024-23986521, E-mail xrzhxr@126.com。