耐镉菌株的筛选及生物学特性

许钦坤　赵翠燕

摘要：从污染土壤中，分离出1株能高度抗镉和吸附镉的菌株S-1，经初步鉴定为蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus）。对其生物学特性进行研究，结果表明，该菌株在液体细菌培养基中耐镉（Cd）浓度高达600 mg/L；菌株S-1对Cd2+有较好的吸附效果，吸附率高达75.4%。

关键词：筛选；耐镉菌株；生物学特性

中图分类号： X131.3文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）02-0317-02

收稿日期：2014-04-02

基金项目：广东省科技计划（编号：2011B010500018）；广东省韶关市科技计划（编号：313-140513）。

作者简介：许钦坤（1977—），男，山东单县人，硕士，讲师，主要从事资源微生物利用研究。

通信作者：赵翠燕。E-mail：bethzhao2003@163.com。镉（Cd）是严重危害人类健康的重金属元素，极微量就会对人体造成危害，镉进入人体后，可对肾脏、骨骼、肺部、心血管等器官造成危害。许多农村、城市的土壤和水资源受到不同程度的镉污染，用受污染的水灌溉时，可使灌区和下游地区的农作物受镉污染，并富集于农作物中，从而进一步危害人体健康。另外，自然环境一旦被镉污染，消除其影响是很困难的。生物修复技术是重金属污染土壤治理的重要手段之一，具有处理费用低、对环境影响小、效率高等优点，目前，利用微生物进行重金属污染土壤的修复是近几年国内外研究的热点。微生物是通过代谢活动及其产物来促进重金属的溶解，从而提高重金属在土壤中的生物有效性[1]，微生物还能促进植物旺盛生长，增大植物生物量，通过强化植物来修复重金属污染土壤。本研究从镉污染土壤中分离耐镉细菌，对其进行初步研究，以期为该细菌在镉污染治理中的应用提供理论基础。

1材料与方法

1.1试验材料

1.1.1土壤样品采自广东某铅锌矿区周围土壤。

1.1.2培养基和试剂牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏3 g、蛋白胨6 g、NaCl 3 g、琼脂粉12.0 g、水600 mL，pH值为7.0～7.2；液体培养基：不加琼脂的牛肉膏蛋白胨培养基；筛选培养基：在固体牛肉膏蛋白胨培养基中，加人不同浓度的Cd2+溶液。硝酸镉、牛肉膏、蛋白胨、琼脂等试剂，化学纯，均为国产；细菌基因组DNA小量提取试剂盒、凝胶回收试剂盒等，均购于大连宝生物工程有限公司；Goldview，购于广州瑞真公司。

1.1.3主要仪器手提式压力蒸汽灭菌器，上海博迅实业有限公司医疗设备厂生产；MAKE KA-1000型低速离心机，海安亭科学仪器厂生产；恒温振荡培养箱，金坛市晶玻实验仪器厂生产；SW-CJ-2FD型双人单面净化工作台，苏州净化设备有限公司生产。

1.2试验方法

1.2.1菌种的培养及分离纯化试验选用稀释平板法[2]，在无菌条件下，将一定量的土样放入一定体积的无菌水中，用移液管反复吹洗，直至颗粒状样品打散，摇匀，分别配制10-2、10-3、10-4、10-5菌悬液；分别吸取0.1 mL菌液，置于含有40 mg/L Cd2+的牛肉膏蛋白胨培养基内，涂布均匀，倒置于37 ℃培养箱中培养24 h；待长出菌落后，挑取光滑透明、湿润的单菌落划线分离，在37 ℃下倒置培养24 h，获得其纯培养；进一步转接到含有100 mg/L Cd2+的牛肉膏蛋白胨培养基中，选用长势较好的菌作斜面，4 ℃冰箱内保存。

1.2.2菌株常规生理生化鉴定参照《常见细菌系统鉴定手册》[3]，对菌株进行系列生理生化特性试验，主要包括甲基红试验、乙酰甲基醇试验、淀粉水解试验、过氧化氢酶试验、明胶液化试验及吲哚试验等，每组2个平行。

1.2.3耐镉菌株16S rRNA 基因序列分析将筛选到的菌株接种到培养基平板上，倒置于37 ℃培养箱中培养24 h；取单菌落到液体培养基中摇床培养过夜；用细菌基因组DNA小量提取试剂盒提取总DNA为模板，进行16S rRNA 基因PCR 扩增，所用引物为27 F ：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和R1492：5′-GGCTACCTTGTTACGACTT-3′[4]。PCR总反应体系为：10×buffer 25 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，模板DNA 1 μL，dNTPs 0.5μL，Taq DNA聚合酶0.5 μL，去离子水补至50 μL。PCR反应条件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，56 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，35个循环；72 ℃延伸7 min。取 5 μL PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，由上海生工公司测序；将16S rDNA的测序结果输入基因库（GenBank）进行序列比对。

1.2.4菌株对镉的耐受性配制含Cd2+浓度分别为0、100、200、300、400、500、600、700、800 mg/L的牛肉膏蛋白胨培养液；将斜面保存的菌株在无镉液体培养基中活化24 h，以2%接种量接入培养液中，37 ℃振荡培养24 h，观察菌株生长情况。

1.2.5菌株对镉的吸收性能将斜面保存的菌株转接到牛肉膏蛋白胨液体培养基中，37 ℃振荡培养24 h；吸取菌液 0.5 mL 接入50 mL灭菌、含Cd2+100 mg/L的牛肉膏蛋白胨液体培养基，以不加菌株、直接加入0.5 mL无菌水为对照培养基，于37 ℃下振荡培养24 h；细菌悬浮液经12 000 r/min离心5 min，取其上清液；用原子吸收仪测定上清液中镉的浓度，计算菌株对培养液中有效镉的吸附率：吸附率=（C0-C1）/C0×100%，式中，C0为对照的镉浓度（mg/L ），C1为吸附后上清液的镉浓度（mg/L）[5]。试验重复3 次。

2结果与分析endprint

2.1耐镉菌株的筛选

从含Cd2+100 mg/L的培养基中分离得到1株耐镉细菌，菌落乳白色，表面粗糙，不透明，经革兰氏染色呈阴性；菌体杆状，命名为S-1。经生理生化试验分析，结果表明，菌株S-1甲基红、乙酰甲基甲醇、淀粉酶、过氧化氢酶、明胶液化试验检测均呈阳性，吲哚试验检测呈阴性。

利用细菌16S rDNA通用引物进行PCR扩增，得到长度约为1 500 bp的扩增产物（图1）。Blast比对分析显示，菌株S-1与Bacillus cereus AF290547的16S rDNA 序列同源性高达97%，结合形态观察和生理生化试验结果，表明 S-1菌株为蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus）。

2.2菌株对镉的耐受性

菌株S-1在含Cd2+浓度范围0～200 mg/L的液体培养基中生长良好；Cd2+浓度超过300 mg/L时，菌株S-1的生长受到抑制；当Cd2+浓度增加到超过700 mg/L时，菌株S-1的生长完全被抑制。这说明菌株S-1对Cd2+的最大耐受浓度为600 mg/L。

2.3菌株对镉的吸收性能

菌株S-1在含Cd2+100 mg/L的培养基37 ℃下振荡培养24 h，离心，收集上清液，过原子吸收仪测定上清液中Cd2+的浓度，结果表明，菌株S-1对Cd2+的吸附率为75.4%。

3结论

试验筛选到1株耐镉菌株S-1，经生理生化试验和16S rRNA序列分析，鉴定该菌株为蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus）；菌株S-1的Cd2+最大耐受浓度为600 mg/L，对Cd2+的吸附率为75.4%。菌株S-1对镉具有较强的抗性和富集能力，在镉污染治理中有良好的应用前景。

参考文献：

[1]陈素华，孙铁珩，周启星，等. 微生物与重金属间的相互作用及其应用研究[J]. 应用生态学报，2002，13（2）：239-242.

[2]中国科学院微生物研究所细菌分类组.一般细菌常用鉴定方法[M]. 北京：科学出版社，1978.

[3]东秀珠，蔡妙英. 常见细菌系统鉴定手册[M]. 北京：科学出版社，2001.

[4]Weisburg W G，Barns S M，Pelletier D A，et al. 16S ribosomal DNA amplification for phylogenetic study[J]. Journal of Bacteriology，1991，173（2）：697-703.

[5]王俊丽，任建国. 耐镉微生物的筛选及其吸附能力研究[J]. 湖北农业科学，2011，50（3）：499-502.姜晓龙，金磊磊，陈辉辉，等. 1株侵染蓖麻的葡萄座腔菌菌株鉴定[J]. 江苏农业科学，2015，43（2）：319-322.endprint