血浆激肽释放酶水平与成人隐匿性自身免疫性糖尿病的关系＊

秦 雯，覃保瑜，夏 宁

（广西医科大学第一附属医院：1.病理科2.老年内分泌科；3.内分泌代谢病科，南宁530021）

世界卫生组织将糖尿病视为一种常见的流行病。初步估计至2015年，在超过30岁的成年人群中糖尿病的发病率将增加60%，且高发年龄将为45～64岁[1]，其中既包括2型糖尿病（T2DM），也包括成人隐匿性自身免疫性糖尿病（latent autoimmune diabetes in the adult，LADA），此二者在发病初期难以鉴别。对糖尿病进行正确分类才能做到早期、适当治疗，降低发生微血管并发症的概率[2-3]。尤其对于LADA患者，由于其可能会迅速进入胰岛β细胞衰竭和胰岛素缺乏期，早期及时诊断并给予胰岛素治疗可有效控制血糖，保存剩余β细胞功能，延缓并发症的发生。目前，在临床检验中常通过一些胰腺自身抗体来初步鉴别自身免疫性糖尿病。然而这些自身抗体不仅种类繁多，而且无论是阳性率还是敏感性在LADA患者中均相对较低[4]。因此，探索有别于自身抗体的指标，更早地预测LADA是本研究的目的所在。不少研究报道都揭示了炎性反应在经典1型糖尿病（T1DM）和LADA发病过程中所起的作用[5-8]。有研究证实在链脲佐菌素制造的T1DM鼠模型中，致炎因子血浆激肽释放酶（KLKB1）在循环血中的水平是升高的[9]；而LADA与T1DM同为自身免疫性糖尿病，其血浆中KLKB1水平的变化尚无相关报道。本研究旨在探讨KLKB1在早期LADA患者血浆中的变化及与早期预测LADA的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料 各疾病组均选自2011年8月至2011年12月在本院就诊的新诊断糖尿病患者，病程均小于1年，收集标本前患者均未接受其他治疗且知情同意。糖尿病诊断采用2003年美国糖尿病协会（ADA）诊断标准；而LADA的诊断目前尚无统一标准，本研究采用Fourlanos等[10]和周智广等[11]提出的标准。LADA组58例，其中男32例，女26例，平均年龄（37.22±5.08）岁，平均病程（4.81±1.12）个月。T1DM 组52例，其中男28例，女24例，平均年龄（12.19±3.80）岁，平均病程（4.52±1.23）个月。T2DM 组65例，其中男37例，女28例，平均年龄（38.23±4.73）岁，平均病程（4.68±1.23）个月。各组受检者的年龄、性别构成及病程间有均衡性。另选同期健康自愿者83例为健康对照组（NC组），其中男48例，女35例，平均年龄（36.84±4.66）岁。

表1 各组一般临床资料及生化指标比较（±s）

表1 各组一般临床资料及生化指标比较（±s）

-：无数据；a：P＜0.05，与LADA组比较。

）]LADA组 58 32／26 37.2±5.1 4.8±1.1 8.2±0.8 9.2±1.7 15.8±1.5 0.71（0.63，0.76） 1.3±0.2 58（100）组别 n 性别（男／女）年龄（岁）病程（月）HbA1c（%）FPG（mmol／L）2hPG（mmol／L）FCP[M（P25，P75），ng／mL]2hCP（ng／mL）GADA[n（%T1DM 组 52 28／24 12.2±3.8a4.5±1.2 8.6±0.8a10.0±1.6a17.0±1.9a0.53（0.43，0.65）a1.0±0.2a52（100）T2DM 组 65 37／28 38.2±4.7 4.7±1.2 7.8±0.7a9.0±1.2 13.8±0.8a1.87（1.65，2.16）a6.0±1.5a0（0）a NC组 83 48／35 36.8±4.7 - 5.1±0.4a5.1±0.7a 6.1±1.1a1.48（1.25，1.79）a5.6±1.9a0（0）a

1.2 方法 晨起抽空腹血查空腹血糖（FPG）、糖化血红蛋白（HbA1c）、空腹C肽水平（FCP），进食100g馒头后2h抽查餐后2h血糖（2hPG）、餐后2hC肽（2hCP）。FPG、2hPG采用西门子公司ADVIA2400全自动生化仪葡萄糖氧化酶法测定。FCP、2hCP的检测使用美国DPC公司全自动化学发光免疫分析仪（IMMULATE-1000），采用化学发光法。HbA1c采用Bio-Rad公司全自动糖化血红蛋白仪高效液相法检测。另留2份血样，分离血浆，-80℃保存，1份用于谷氨酸脱羧酶抗体（glutamic acid decarboxylase，GADA）的测定（ELISA法，北京北方生物技术研究所），1份用于KLKB1的测定（ELISA法，武汉优尔生科技股份有限公司）。

1.3 统计学处理 使用SPSS16.0统计软件进行分析，计量资料予以正态性检验，对符合正态分布变量表示为±s，LADA组与其他各组KLKB1值组间比较采用单因素方差分析；对非正态分布变量用百分位数表示，采用非参数检验方法；计数资料采用χ2检验；血浆KLKB1和其他指标相关性分析采用Spearman相关分析，多因素分析采用多元线性回归法（逐步法）；使用受试者工作特征曲线（ROC曲线）分析血浆KLKB1对LADA临床早期诊断的意义，检验水准α＝0.05，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组一般临床资料及实验室指标比较 LADA组与其他各组在性别构成、病程（NC组除外）方面差异无统计学意义（P＞0.05）。LADA组与其他各组（T1DM组除外）在年龄方面差异无统计学意义（P＞0.05）。LADA组与其他各组的FPG（T2DM 组除外）、2hPG、HbA1c、FCP、2hCP指标方面差异有统计学意义（P＜0.05）。LADA组与其他各组（T1DM组除外）GADA的差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。

2.2 血浆KLKB1水平在各组中的比较 血浆KLKB1在LADA组中的值为（29.44±7.22）μg／mL，明显高于 T2DM 组的（24.76±6.88）μg／mL和 NC组的（25.61±6.86）μg／mL，差异有统计学意义（P＜0.05）；同时也高于T1DM 组的（28.27±7.86）μg／mL，但差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.3 LADA组患者血浆KLKB1水平相关因素分析 经Spearman相关分析，LADA组血浆KLKB1含量与年龄、病程、2hCP无明显相关性（P＞0.05），与FCP呈负相关（P＜0.05），与 HbA1c、FPG、2hPG呈正相关（P＜0.05），见表2。进一步以 KLKB1为因变量，以年龄、病程、FPG、2hPG、HbA1c、FCP、2hCP各项指标为自变量，进行多元线性回归分析，仅有病程、FCP进入回归方程（P＜0.05）。见表3。

表2 KLKB1与其他观察指标的Spearman相关分析结果

表3 以KLKB1为因变量的多元线性回归分析

2.4 血浆KLKB1值早期预测LADA的灵敏性、特异性及临界值探讨 为证实血浆KLKB1值在鉴别LADA和T2DM中的价值，绘制ROC曲线。同时，计算出其预测LADA的灵敏度、特异度和临界值。经计算，血浆KLKB1预测LADA的临界值为20.60μg／mL，灵敏度为0.88，特异度为0.38，见图1。

图1 KLKB1预测LADA的ROC曲线

3 讨论

目前诊断LADA的直接证据是检测到血液中与之相关的多种自身免疫抗体，如胰岛细胞质抗体、胰岛细胞表面抗体、胰岛素自身抗体、GADA等[12]。间接证据有标志胰岛β细胞功能的胰岛素及C-肽水平的降低。然而有研究显示，即使是T2DM患者，其胰岛自身免疫抗体也有17.21%的阳性率[13]。胰岛素因在肝肾内分解且半衰期短而影响测量结果的准确性，不少患者在LADA的发病初期C肽值无明显变化，这些都导致了LADA的误诊或漏诊。

KLKB1是一种由激肽释放酶原产生的丝氨酸蛋白酶，也是由KLKB1基因表达的一种丰富的循环酶原。它本质上是一种水解酶，作用于肽键，也就是丝氨酸肽链内切酶。它所参与的补体及凝集通路是血浆中一连串蛋白水解的串联通路，是针对病原体的非特异性防御机制。补体的激活有3条路径：经典路径、外源凝集素路径和替代路径，所有路径产生决定性的酶活性，并依次产生补体效应分子。补体激活的主要结果是产生了调理素，补充炎性细胞和免疫活性细胞。KLKB1所参与的生物过程除了经典的血液凝固过程、纤溶过程、止血过程外，还有炎性反应过程。因此，它在许多疾病中都有致炎因子的作用，而这一方面通常被研究者们忽略。所以有学者认为有必要评估KLKB1在胰岛炎及在最终发展成T1DM过程中的作用[14-15]。

最近对KLKB1的基因学、分子学和药理学研究使人们对其生理和病理角色有了更深入的理解。基因分析发现KLKB1的变构体与血液中的代谢物水平、高血压和凝集作用有关。以KLKB1基因缺陷为特征的动物模型和KLKB1抑制物都已证实了其在炎症、血管功能、血压调节、血栓形成、糖尿病和代谢等方面的作用[16-17]。

本研究通过对LADA组与T1DM组、T2DM组、NC组的血浆KLKB1水平对比分析发现，KLKB1在LADA组与T1DM组中的绝对定量值非常相近，经统计学分析发现两者的差异无统计学意义。而血浆KLKB1水平在LADA组与T2DM组、NC组中的差异有统计学意义，在LADA组中呈明显上调的趋势。有很多自身免疫性疾病发病的早期常有炎性反应的表现，如链球菌感染后的急性肾小球肾炎发病早期，在能检测出自身抗体前其补体水平就已明显下降。对于T1DM和LADA的发病机制，目前已知它们都属于自身免疫性疾病，而这些自身抗体产生的真正原因并未阐明，是否有炎症因素参与到疾病的始动环节尚无定论。本研究中血浆KLKB1水平在早期LADA和T1DM患者中上调提示，炎症因素很可能在疾病的早期已经开始发挥作用。通过对LADA组血浆KLKB1水平的相关因素分析和多元线性回归分析发现，FCP是LADA组血浆KLKB1水平的主要影响因素，而FCP又是反映患者糖代谢及胰岛β细胞功能的重要指标，这就从一个侧面证实KLKB1极有可能参与了LADA的病理生理过程。据此推测，纠正KLKB1过高的状态有可能使LADA患者获益，但该设想尚需进一步深入研究证实。由于KLKB1在LADA发病的初期就已经升高了，本研究采用ROC曲线进一步分析KLKB1是否能作为早期预测LADA的指标，结果显示KLKB1蛋白对LADA的早期诊断预测性一般，故单独应用KLKB1对LADA进行诊断或鉴别诊断具有较大局限性。

综上所述，KLKB1对判断LADA发病风险和早期诊断LADA有一定意义，可在LADA高危人群中结合其他指标进行筛选、监控。如果在KLKB1升高的同时发现胰岛素、FCP等指标异常，应及早干预治疗，尽量保护残留的胰岛β细胞，阻止或延缓LADA的发生。此外，由于本研究样本含量有限，尚需从分子水平进一步探明KLKB1在LADA发生、发展中的作用机制。

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