Slit2蛋白对TNF-α诱导的大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞增殖迁移的影响

刘丽华，刘 涛，王浩宇，陈桂秀，倪 伟，邓学云

（1.川北医学院第二临床医学院／四川省南充市中心医院：1.老年病科；2.心内科；3.神经外科 637000）

平滑肌细胞从血管中膜迁移到内膜、增殖并分泌大量的细胞外基质在动脉粥样硬化和血管成形术后再狭窄中有重要作用[1]。研究发现Slit家族成员之一Slit2蛋白能阻止血小板源性生长因子（platelet derived growth factor，PDGF）诱导的人主动脉平滑肌细胞（vascular smooth musle cells，HASMCs）迁移[2]。TNF-α与PDGF同属炎性反应产物，在促进平滑肌细胞迁移的过程中，二者能激活共同的、互补的信号传导机制[3]，且在肿瘤细胞中TNF-α能引起Slit2蛋白表达增加[4-5]。因此作者推测Slit2对TNF-α在VSMCs上的作用可能有影响，并通过本研究进行论证。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器 大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞由川北医学院组织工程干细胞研究所自行培养；DMEM培养液／高糖、胎牛血清（FBS）购自Hyclone公司，0.25%胰蛋白酶购自Invitrogen公司，青霉素、链霉素混合液购自KeyGEN公司，TNF-α、重组大鼠Slit2购自R＆D公司，CCK-8溶液购自碧云天公司。倒置荧光显微镜（Nikon公司），自动酶标仪（Anthos公司），transwell小室（Millipore公司）。

1.2 方法

1.2.1 Slit2对血管平滑肌细胞增殖迁移的影响 （1）取对数生长期的VSMCs，以浓度2×104／mL接种于96孔板，每孔100μL培养基，放入5%CO2培养箱培养，待细胞的贴壁融合率达80%左右时，吸弃培养基。实验分为正常对照组和实验组，正常对照组含有20%FBS的DMEM培养液；实验组含有20%FBS的DMEM培养液及Slit2蛋白，使Slit2蛋白的浓度分别为50、75、100、125、150ng／mL。每组设6个复孔，孵育24 h，实验终止前1h每孔加入10μL CCK-8溶液，继续培养1h后，在450nm波长处测定OD值。（2）取对数生长期的VSMCs以浓度1×104／孔的细胞悬液接种到transwel小室上室，向transwel小室下室24孔板中加入含Slit2蛋白的培养基800μL分为正常对照组和实验组，正常对照组含有20%FBS的DMEM培养液；实验组含有20%FBS的DMEM培养液及Slit2蛋白，使Slit2蛋白的浓度分别为50、75、100、125、150ng／mL。于37℃、5%CO2培养箱中培养24h后，使细胞迁移至基底膜下；取出小室，用棉签将滤膜上表面未迁移过去的细胞拭去，晾干小室，甲醇固定，0.1%结晶紫染色，倒置显微镜下计数滤膜下细胞数目（×200）。每张基底膜选取9个视野。

1.2.2 Slit2对TNF-α诱导的血管平滑肌细胞增殖迁移的影响 实验分为正常对照组、阳性对照组和实验组，正常对照组不含TNF-α及Slit2蛋白；阳性对照组含TNF-α10ng／mL；实验组分别含TNF-α10ng／mL＋Slit2 50ng／mL，TNF-α10ng／mL＋Slit2 75ng／mL，TNF-α10ng／mL＋Slit2 100ng／mL，TNF-α10ng／mL＋Slit2 125ng／mL，TNF-α10ng／mL＋Slit2 150ng／mL。按照上述方法分别进行增殖及迁移实验。

1.3 统计学处理 采用SPSS13.0统计软件进行分析，计量资料以±s表示，多组间变量的差异使用单因素方差分析，组间比较用LSD和SNK法，检验水准α＝0.05，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Slit2对VSMCs增殖迁移的影响 对数生长期的VSMCs，加入不同浓度的Slit2后，采用CCK-8法检测细胞增殖变化，分光光度计测得各组OD值变化，差异无统计学意义（P＝0.516），见图1；transwel结果显示各实验组与对照组细胞迁移数目比较差异无统计学意义（P＝0.52），见图2。提示在24h内Slit2蛋白（50～150ng／mL）对VSMCs增殖迁移均没有明显作用。

图1 Slit2对VSMCs增殖的影响

2.2 Slit2对TNF-α诱导的VSMCs增殖迁移的影响 实验组和阳性对照组的OD值与正常对照组的OD值比较差异有统计学意义（P＜0.05），而实验组与阳性对照组的OD值比较差异无统计学意义（P＝0.173），提示Slit2对10ng／mL TNF-α诱导的VSMCs增殖没有明显作用。transwel结果显示实验组细胞数目较阳性对照组细胞数目明显减少。提示Slit2（50～150ng／mL）能抑制10ng／mL TNF-α诱导的VSMCs迁移，且其抑制作用有浓度依赖性，浓度越大，抑制作用越明显，当Slit2浓度达125ng／mL时其抑制作用随浓度增加变化不再明显，见图3～5。

图2 Slit2对VSMCs迁移的影响（±s，个，n＝9）

图3 Slit2对TNF-α诱导的VSMCs增殖的影响

图4 Slit2对TNF-α诱导的VSMCs迁移的影响

图5 Slit2对平滑肌细胞迁移的影响（×200）

3 讨论

Slit-Robo信号通路能调控神经轴突导向、神经元迁移及白细胞趋化，还能调节内皮细胞及心内膜细胞的迁移，影响管腔形成及血管重建[6-7]。在前期实验中，作者在VSMCs上检测到了Slit2的表达，且在TNF-α作用下Slit2的表达有变化，提示Slit2蛋白在VSMCs上可能有一定的作用。于是作者对Slit2蛋白在VSMCs上作用进行研究。研究结果显示：加入不同浓度的Slit2蛋白后各组细胞的OD值与对照组比较差异均无统计学意义（P＞0.05），提示Slit2对VSMCs的增殖没有明显作用。且在10ng／mL TNF-α作用下，实验组OD值与10 ng／mL TNF-α组比较，差异仍无统计学意义（P＞0.05）。Liu等[2]通过细胞对胸腺嘧啶的摄入量来检测DNA合成，结果显示无论在有无PDGF状态下，Slit2-N／1118对VSMCs的增殖均没有影响，与本研究结果一致。迁移实验中本研究观察到加入Slit2蛋后，细胞迁移数目与对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05），提示Slit2蛋白对VSMCs迁移没有明显作用。但10ng／mL TNF-α＋Slit2组的细胞迁移数目比10ng／mL TNF-α组明显减少，且表现出浓度依赖的特点，提示Slit2抑制了TNF-α诱导的细胞迁移。Ning等[8]在报道通过划痕法及改良Boyden小室法观察Slit2蛋白对气管平滑肌细胞的影响，发现在没有PDGF的状态下，Slit2蛋白对细胞迁移没有明显作用；但当加入PDGF后，Slit2对PDGF诱导的平滑肌细胞迁移表现出抑制效应。Liu等[2]也通过transwell小室法发现在没有PDGF的状态下外源性Slit2蛋白对VSMCs迁移没有影响；加入PDGF后，细胞板状伪足形成，细胞胞体延长，应力纤维减少甚至消失，细胞迁移增加；而Slit2-N／1118阻止板状伪足的形成，使细胞恢复到富含应力纤维的不规则形态，最终抑制了PDGF诱导的VSMCs的迁移[2，8]。本研究发现，Slit2能抑制TNF-α引起的内皮细胞通透性的改变[9]，从而抑制炎性反应。而TNF-α与PDGF均是炎性反应的产物，Slit2对TNF-α和PDGF作用下的VSMCs的作用表明：Slit2可能通过血管平滑肌细胞对血管炎性反应产生一定的作用。

细胞迁移是细胞骨架发生的协调性重建活动，包括机动蛋白聚合，粘着斑形成，肌动球蛋白收缩等复杂过程。而平滑肌细胞迁移的重要信号通路及效应蛋白有小G蛋白，磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol 3-kinases，PI3-K），Rho活化蛋白激酶（Rho activated protein kinase，ROCK），p21活化蛋白激酶（p21-activated protein kinases，PAK）[10]，Src家族酪氨酸激酶（Src family tyrosine kinases）和促分裂素原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPK）等[11]。关于Slit2蛋白对VSMCs迁移的具体作用环节及效应蛋白目前还不清楚，仍需进一步研究。

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