茶多酚对大鼠骨关节软骨氧化损伤的保护作用

严 斌 余 非 王立胜 韩士英.广东省深圳市坪山新区人民医院骨科，广东深圳 58000；.广东医学院附属西乡人民医院骨科，广东深圳 58000；.中山大学附属第一医院骨科，广东广州 50080

茶多酚对大鼠骨关节软骨氧化损伤的保护作用

严 斌1余 非2王立胜2韩士英3
1.广东省深圳市坪山新区人民医院骨科，广东深圳 518000；2.广东医学院附属西乡人民医院骨科，广东深圳 518000；3.中山大学附属第一医院骨科，广东广州 510080

目的探讨茶多酚对大鼠骨关节软骨氧化损伤的保护作用，以进一步了解茶多酚摄入机体对骨折早期愈合的影响机制。方法选取3～4月龄健康雄性Sprague-Dawley大鼠45只作为观察对象，随机将其分为A、B、C三组，每组15只。各组均制造骨折前茶多酚生物效应，对三组大鼠进行皮下注射，A组剂量为5 mg/（kg·d）茶多酚，B组剂量为10 mg/（kg·d）茶多酚，而C组剂量为0.5 mL/（kg·d）生理盐水；注射3周后，将每只大鼠桡骨中下1/3交界处造成左侧桡骨3 mm完全骨质缺损的骨折模型，不固定；骨折后继续注射茶多酚，制造骨折后茶多酚生物效应；采用HE染色分别观察大鼠在骨折愈合不同时期（造模后3、7、14、21 d）的骨痂厚度及骨痂成熟度。 结果①骨痂厚度：经HE染色观察，造模后3 d，三组间比较差异无统计学意义（P＞0.05）；造模后7 d，B组明显高于其他两组，差异有统计学意义（P＜0.05）；造模后14 d，A组与B组明显高于C组，差异有统计学意义（P＜0.05）；造模后21 d，B组明显高于A组与C组，且A组明显高于C组，各组间差异均有统计学意义（P＜0.05）。②A组与B组大鼠术后3 d即可见到骨内外膜开始增厚，术后7 d骨折端肉芽组织形成，术后14 d骨折端肉芽组织开始重新生长，术后21 d骨折端纤维性骨痂与纤维母细胞有明显减少；C组术后3、7 d骨内外膜也有所增厚，但是与术前相比差异不明显，术后14、21 d骨痂中纤维细胞、毛细血管密度及纤维性结缔组织有明显增加，出现新生血管，但是成骨细胞的增殖数量与A、B组相比明显偏低，而且骨痂的成熟度也相对较低，内外骨痂改造塑形期出现较晚。 结论茶多酚对骨关节软骨氧化损伤具有明显的保护作用，其可以通过促进骨痂增殖分化，增加骨痂含量，加快骨痂的成熟，从而提高骨折的愈合速度。

茶多酚；骨关节软骨；氧化损伤；保护；肿瘤坏死因子

骨折后形成的骨痴组织对骨的修复、愈合过程至关重要，也是骨折愈合程度的评定标准［1-2］。茶多酚对机体细胞和组织具有复杂的生物效应，本课题拟采用动物实验方法研究茶多酚对大鼠骨折愈合的影响，通过建立茶多酚生物效应下的骨折愈合模型，使用HE染色法检测骨痂厚度及成熟度，使用免疫组化染色法检测骨痂中肿瘤坏死因子（TNF-α）表达水平来探讨茶多酚对骨折愈合的早期影响。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选取3～4月龄健康雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠45只，作为本组研究的观察对象，随机将其分为A、B、C三组，每组15只。入选标准［3］：SPF级SD大鼠；雄性；7周龄，体重（260±20）g，避免大龄大鼠骨折后愈合差对实验的干扰。

1.2 方法

A、B、C三组均制造骨折前茶多酚生物效应，对三组大鼠进行皮下注射，A组剂量为5 mg/（kg·d）茶多酚，B组剂量为10 mg/（kg·d）茶多酚，而C组剂量为0.5 mL/（kg·d）生理盐水；注射3周后，将每只大鼠桡骨中下1/3交界处造成左侧桡骨3 mm完全骨质缺损的骨折模型，不固定；骨折后继续注射茶多酚，制造骨折后茶多酚生物效应。采用HE染色分别观察大鼠在骨折愈合不同时期（造模后3、7、14、21 d）的骨痂厚度及骨痂成熟度［4］。

1.2.1 主要设备与试剂 Leica-SPl600型锯齿切片机（德国/型号Leica徕卡，上海仁科生物科技有限公司进口）、DHG-9145A型鼓风干燥箱 （型号：DHG-9145A，上海一恒科技有限公司生产）、CA950-2超净台 （苏州安泰净化仪器厂生产）、冰箱 （青岛海尔）、TGL-16C台式离心机 （上海安亭科学仪器厂生产）、倒置相差荧光显微镜（美国Olympus公司生产）、流式细胞仪 （美国贝克曼库尔特有限公司生产，型号：EPICSRALTRA）、酶标记仪（美国Bio-RAD公司生产，型号：Bio-rad680）、可调式微量移液仪 （法国Gilson公司，型号：吉尔森F123603）、电热恒温水浴箱（上海医用恒温设备厂生产）、隔水式电热恒温箱（上海跃进医疗器械厂生产）、手术刀片（上海医疗器械公司生产）、蚊氏血管嵌（上海医疗器械公司生产）、持针器（上海医疗器械公司生产）、5 mL注射器针头［碧迪医疗器械（上海）有限公司生产］。

1.2.2 影像学检查 所有大鼠均取俯卧位，用胶带固定在解剖台板上，经足量致死量麻醉处死后（目前实验中常用的大鼠处死方法有脊椎脱臼法、击打法、断头法、急性大失血法及空气栓塞法等，但操作过于复杂，而且大鼠痛苦较大，因此本组实验采用腹腔内注射过量麻药的处死方法，保证实验动物在影像学检查中保持安静），行术侧股骨干侧位X线拍片，将X线机摄片放大比例、投射灯与术侧股骨干的垂直距离调为一致，拍片后准确记录拍摄时间并妥善保存。

1.2.3 标本取材 X线拍片后，开始对术侧股骨干标本进行取材，取材范围为近端完整股骨头至远端股骨髁的股骨干全长，包括近端股骨头，远端股骨髁，不包括髌骨，并将髓腔内柯氏针拔除，用组织剪尽可能去除肌肉等软组织仅保留股骨干，操作时动作要轻，避免粗暴致使新生骨痂遭到破坏，修剪后用清水将残屑及残留的组织冲洗干净进行湿重称量［5］。标本称重后对于其进行修整，由于标本硬度较高，在处理时要避免由于用力过猛人为导致二次骨折的发生。修整完成后再次用清水对标本进行彻底冲洗，并浸泡于固定液（10%甲醛+70%乙醇+）中保存备用。

1.2.4 脱钙 本组研究中采用福尔马林作为固定剂，首先锯取厚度约0.5 cm骨片，经10%甲醛固定液固定24 h后，再经10%甲醛固定液固定2 d；将骨块置于浓度为15%的乙二胺四乙酸（EDTA）脱钙剂中［6］，浸泡4～6周；所有标本经脱钙处理后，均应通过针刺法对于脱钙效果进行评估，如果标本很容易被刺透且阴力较小，则说明脱钙完全成功；如果仍然感觉阴力过大则应重新进行脱钙处理，方法与上述方法一致。

1.2.5 HE染色 切片脱蜡处理采用二甲苯，脱蜡后用酒精将切片上的二甲苯彻底消除，用电吹风吹干，增加切片附贴的牢固性，保证了染色的成功率；切片在放入苏木糖染液前应用电吹风吹干水分，避免苏木精染液浓度与pH值发生变化，达到延长使用寿命的目的［7］。脱蜡处理后，要避免切片干涸影响切片的无水效果。可在切片上留有少量二甲苯，使其与潮湿空气隔绝，保证切片无水，同时滴上中性树胶，保证保存效果。

1.3 统计学方法

采用统计软件SPSS 15.0对实验数据进行分析，计量资料数据以均数±标准差（x±s）表示，采用t检验。计数资料以率表示，采用χ2检验。成熟度测量使用描述分析［8］。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 骨痂厚度

经HE染色观察，造模后3 d，三组间比较差异无统计学意义（P＞0.05）；造模后7 d，B组明显高于其他两组，差异有统计学意义（P＜0.05）；造模后14 d，A组与B组明显高于C组，差异有统计学意义（P＜0.05）；造模后21 d，B组明显高于A组与C组，且A组明显高于C组，各组间差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

2.2 骨痂成熟度

A组与B组大鼠术后3 d即可见到骨内外膜开始增厚，术后7 d有新生血管出现，骨折端肉芽组织形成，骨折间隙出现大量纤维母细胞并有少量的成骨细胞；术后14 d骨折端肉芽组织、新生毛细血管与纤维性骨痂开始重新生长，骨生成细胞大量出现；术后21 d骨折端纤维性骨痂与纤维母细胞有明显减少，纤维性骨痂逐渐被软骨骨痂和编织骨痂所取代；C组术后3、7 d骨内、外膜也有所增厚，但是与术前相比差异不明显，骨原细胞逐渐增生形成骨样组织与软骨，术后14、21 d骨痂中纤维细胞、毛细血管密度及纤维性结缔组织有明显增加，出现新生血管，但是成骨细胞的增殖数量与A、B组相比明显偏低，而且骨痂的成熟度也相对较低，内外骨痂改造塑形期出现较晚。

3 讨论

临床中一般将骨折的愈合过程分为三个阶段［9］：第一阶段是炎症阶段，即创作局部组织的自我调整，此时局部坏死的组织会被清除或吸收；骨折早期由于周围血肿被逐步清除，骨折局部充质细胞大量增殖，同时释放转化生长因子、骨形成蛋白、血管内皮细胞生长因子等，加快间充质细胞转化为成骨细胞的速度。第二阶段是修复阶段，主要是指新生组织（即膜内化骨与软骨内化骨）修复［10］；软骨细胞在钙化过程中会分泌Ⅰ型胶原生平骨基质蛋白，诱发骨基质矿化，从而形成编织骨。编织骨会沿着应力方向进行规律的、斜形螺旋状排列。第三阶段是塑形阶段，经过前两个阶段的恢复，创作局部的骨折端与周围组织已经进入正常生长发育期，为进一步愈合提供条件，编织骨会逐渐转化为板层骨，基本恢复了骨的原有结构和功能，相邻的骨板胶原纤维走向会呈现互相交叉的三维状态，以增强其在各个方向上的抗张强度。骨折愈合的过程是一个持续、渐进的过程，同时也是暂时性紧急连接到永久性坚固连接的过程。

骨痂的构建与重塑是整个骨折愈合过程中至关重要的环节［11］，但骨痂成熟程度只与骨痂质量有直接关系，而与骨痂的体积与范围无明显关联。正常骨痂的X线表现为骨痂致密，成骨细胞排列紧密，有少量游离的破骨细胞，骨小梁有规律地沿应力线排列，新生营养血管已经形成，骨陷窝内可见皮质骨。本组研究中，造模后3 d，A、B、C组的骨痂厚度间比较差异无统计学意义（P＞0.05）；造模后7 d，B组的骨痂厚度明显高于A组与两组C组，差异有统计学意义 （P＜0.05）；造模后14 d，A组与B组的骨痂厚度明显高于C组，差异有统计学意义（P＜0.05）；造模后21 d，B组的骨痂厚度明显高于A组与C组，且A组明显高于C组，各组间差异均有统计学意义（均P＜0.05）。说明茶多酚会在一定程度上促进骨痂厚度的增加，而且这种促进作用与茶多酚的使用剂量呈明显的正相关。

软骨细胞损伤的主要临床表现以核固缩、线粒体肿胀、嵴断裂或空泡变性，内质网扩张、脱颗粒等为主［12］，Ⅱ型胶原损伤主要表现为纤维纤细或肿胀、粗大，部分区域纤维融解，结构消失。通过本组研究，可以发现A组与B组大鼠术后3 d即可见到骨内外膜开始增厚，术后7 d骨折端肉芽组织形成，术后14 d骨折端肉芽组织开始重新生长，术后21 d骨折端纤维性骨痂与纤维母细胞有明显减少；C组术后3 d及术后7 d骨内、外膜也有所增厚，但是与术前相比差异不明显，术后14、21 d骨痂中纤维细胞、毛细血管密度及纤维性结缔组织有明显增加，出现新生血管，但是成骨细胞的增殖数量与A、B组相比明显偏低，而且骨痂的成熟度也相对较低，内外骨痂改造塑形期出现较晚。A组与B组的扩张粗面内质网囊腔内可见一定量的蛋白粒子；A组与B组超微病理病变程度有所减轻，提示茶多酚对关节软骨细胞和Ⅱ型胶原的损伤具有一定的保护作用。

活性氧主要包括超氧离子（O2-）、过氧化氢（H2O2）和羟自由基（OH-），广泛存在于人体细胞内，其作用是维持人体细胞信号的正常传导，当抗氧化物酶体系受损时，抗氧化系统及氧化系统会出现功能失衡，从而增加活性氧含量，使线粒体内活性氧大量堆积。有报道称，骨关节病及骨折患者或模型动物的血清和关节液中的氧自由基水平会异常升高，降低谷胧甘肽过氧化物酶、超氧化物歧化酶及氧自由基清除剂的活性［13］，同时增加脂质过氧化产物丙二醛的含量。

茶多酚是茶叶提纯物中的30多种酚类化合物复合体的总称，不是一种单一的物质。茶多酚具有很强的抗氧化作用，而且可以通过多种途径发挥其抗氧化作用，并在一定程度上减少脂质过氧化产物，减轻机体的氧化损伤，茶多酚还能与机体内存在的抗氧化防御体系协同作用，更好地发挥防御系统的作用，维持体内自由基的动态平衡［14］。另外，最新的研究结果证实，茶多酚还具有防止衰老及抗肿瘤和抗辐射的作用，同时在降低血糖、血脂方面也有非常理想的作用，具有明显的抑菌、抑酶等药理功能。有试验证实，茶多酚的抗氧化功效是维生素E的18倍，是维生素C的100倍［15］，通过多个动物实验模型研究表明，茶多酚可以有效地抑制氧化损伤造成的DNA碱基的损伤，并能很好地抑制8-OHdG的累积，其中，8-OHdG为氧化损伤的重要标志物。更重要的是由于茶多酚是天然化合物，临床使用剂量较小，因此在临床治疗中不存在毒副作用，安全性高。

总之，茶多酚对骨关节软骨氧化损伤具有明显的保护作用，其可以通过促进骨痂增殖分化，增加骨痂含量，加快骨痂的成熟，从而提高骨折的愈合速度。

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The protective role of tea polyphenols on oxidative injury of rat articular cartilage

YAN Bin1YU Fei2WANG Lisheng2HAN Shiying3
1.Department of Orthopedics,the People＇s Hospital in Pingshan New District,Guangdong Province,Shenzhen 518000, China;2.Department of Orthopedics,Xixiang People＇s Hospital Affiliated to Guangdong Medical College,Guangdong Province,Shenzhen 518000,China;3.Department of Orthopedics,the First Hospital Affiliated to Zhongshan University, Guangdong Province,Guangzhou 510080,China

ObjectiveTo explore the protection of tea polyphenols on oxidative injury of the rat articular cartilages to further understand the effect of intake of tea polyphenols on the early healing of the fracture.Methods 45 healthy male Sprague-Dawley rats which were 3-4 month old were selected as the research objects and randomly divided into A,B, C three groups,15 rats in each group.The rats in each group manufactured biological effects of tea polyphenols before fracture and the rats in the three groups received subcutaneous injection.The rats in group A were injected 5 mg/(kg·d) of tea polyphenols,rats in group B were injected 10 mg/(kg·d)of tea polyphenols,while rats in group C were injected 0.5 mL/(kg·d)physiological brine.Three weeks after the injection,the fracture model of each rat middle radius 1/3 junction caused by left radius 3 mm complete bone defectis were not fixed;after fracture continue to inject tea polyphenols,tea polyphenols manufacturing fracture afterbiological effects were observed by HE staining;rats in different period of fracture healing (model after 3,7,14,21 d)of bone thickness and bone callus maturity.Results①Callus thickness:observed by HE staining,3 d after modeling,significant comparison between three groups showed that,differences were not statistically significant(P＞0.05);7 d after modeling,group B was significantly higher than the other two groups,differences had statistical significance (P＜0.05);14 d after modeling,group A and group B wassignificantly higher than that in group C,differences were statistical significance(P＜0.05);21 d after modeling,group B was significantly higher than that in group A and group C,and group A was significantly higher than that in group C, differences were statistical significance (P＜0.05).②3 d after the operation in group A and group B rats can be seen in the outer membrane of bonethickens,7 d after operation fracture end of granulation tissue formation,14 d after operation fracture end of granulation tissue growing back,after 21 d fracture of fibrous callus and fibroblast were significantly reduced in group C;3,7 d after operation,bone in outer membrane had thickened,but the difference was not significant compared with the preoperative,postoperativefiber 14,21 d in callus cells,capillary density and fibrous connective tissue increased significantly,neovascularization,but the osteoblast proliferationcompared with group A,group B was significantly lower,and the callus maturity is relatively low,internal,external callus transformation and shaping period appeared later.Conclusion Tea polyphenols has a significant protective effect on articular cartilage of oxidative damage,which canpromote the proliferation and differentiation of the callus,callus content increase,accelerate callus of mature,so improve the fracture healing rate.

Tea polyphenols;Articular cartilage;Oxidative damage;Protection;Tumor necrosis factor

R285

A

1673-7210(2015)01(b)-0016-04

2014-10-17本文编辑：卫 轲）

广东省深圳市宝安区科技计划社会公益项目（编号440430140655）。