续骨冲和膏的质量标准研究

吴凤荣，曾聪彦，胡玉良，卢建业（.广州中医药大学附属中山中医院，广东中山 5840；.广东药学院中药学院，广东中山 58400）

续骨冲和膏由大黄、赤芍、当归、续断、黄柏、独活等20味中药制备而成，是广州中医药大学附属中山中医院的常用经验方，具有活血通络、消肿止痛、疗伤续骨的功效，主要用于治疗跌打瘀伤。由于该制剂尚未建立完善的质量标准，为了控制其产品质量，保证其安全性和有效性，本研究采用薄层色谱（TLC）法对该制剂中的大黄、黄柏、赤芍、当归、骨碎补、独活、荆芥、木香等多味药进行了定性鉴别，并采用高效液相色谱（HPLC）法对制剂中的君药大黄所含的大黄素和大黄酚进行了含量测定。

1 材料

1.1 仪器

1100型HPLC仪（美国安捷伦公司）；KQ3200E型医用超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；BS224S型电子天平（德国赛多利斯公司）；电热恒温水浴锅（上海衡平仪器仪表厂）；TC-15型套式恒温器（浙江新华医疗器械厂）。

1.2 药品与试剂

续骨冲和膏（批号：20131109、20131202、20140108）由广东省中山市中医院制剂室提供；大黄素（批号：110756-200110）、大黄酚（批号：110796-201118）、芍药苷（批号：110736-201136）对照品及黄柏（批号：121510-201105）、大黄（批号：121249-201003）、赤芍（批号：121093-200402）、当归（批号：120927-201315）、骨碎补（批号：121169-200503）、独活（批号：120940-201111）、木香（批号：120921-201008）、荆芥（批号：120911-201110）对照药材均购自中国食品药品检定研究院；硅胶G（青岛海洋化工有限公司分厂，批号：20120208）；其余试剂均为市售分析纯。

2 方法与结果

2.1 TLC鉴别

2.1.1 大黄[1]取本品1.5 g，用玻璃棒分散，加甲醇20 ml，浸泡1 h，滤过，取滤液5 ml，蒸干，残渣加水10 ml使溶解，加盐酸1 ml，水浴加热回流30 min，立即冷却，用乙醚分2次振摇提取，每次20 ml，合并乙醚液，蒸干，残渣加三氯甲烷1 ml使溶解，作为供试品溶液。取大黄对照药材0.1 g，加甲醇20 ml，按供试品溶液的制备方法制成对照药材溶液。取缺大黄的其余药味适量，按处方工艺制成缺大黄的阴性对照品，取约1.5 g，按上述供试品溶液的制备方法制成缺大黄的阴性对照溶液。照TLC法[2010年版《中国药典》（一部）附录ⅥB]试验，吸取上述3种溶液各5 μl分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚（30～60 ℃）-甲酸乙酯-甲酸（15∶5∶1，V/V/V）的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，分别置于日光和紫外光灯（365 nm）下检视。结果，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同的橙黄色荧光斑点；置氨蒸气中熏后，斑点变为红色。大黄的TLC图见图1。

2.1.2 黄柏[2-3]取本品3 g，用玻璃棒分散，加1%醋酸甲醇溶液20 ml，超声（功率：150 W，频率：40 kHz）处理20 min，滤过，滤液浓缩至1 ml，作为供试品溶液。取黄柏对照药材0.1 g，加1%醋酸甲醇20 ml，按供试品溶液的制备方法制成对照药材溶液。取缺黄柏的其余药味制成的阴性对照品3 g，按上述供试品溶液的制备方法制成缺黄柏的阴性对照溶液。照TLC法[2010年版《中国药典》（一部）附录ⅥB]试验，吸取供试品溶液、阴性对照溶液各5 μl及对照药材溶液1 μl分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水（10∶6∶1∶1，V/V/V/V）为展开剂，展开，取出，晾干，分别置日光和紫外光灯（365 nm）下检视。结果，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的黄色斑点和荧光斑点。黄柏的TLC图见图2。

图1 大黄的TLC图A.熏氨蒸气前；B.熏氨蒸气后；C.紫外光灯下；1～3.供试品；4.大黄对照药材；5缺大黄的阴性样品Fig 1 TLC of Rhei RadixA.before fumed with ammonia vapor；B.after fumed with ammonia vapor；C.under UV lamp；1-3.test samples；4.Rhei Radix reference substance；5.negative control without Rhei Radix

图2 黄柏的TLC图A.日光下；B.紫外光灯下；1～3.供试品；4.黄柏对照药材；5.缺黄柏的阴性样品Fig 2 TLC ofP.chineseA.under sunlight；B.under UV lamp；1-3.test samples；4.Phellodendri Chinensis reference substance；5.negative control withoutP.chinese

2.1.3 赤芍[4]取本品22 g，用玻璃棒分散，加乙醇50 ml，振摇5 min，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇2 ml使溶解，作为供试品溶液。取赤芍对照药材0.5 g，加乙醇10 ml，按上述供试品溶液的制备方法制成对照药材溶液。取缺赤芍的其余药味制成的阴性对照品22 g，按上述供试品溶液的制备方法制成缺赤芍的阴性对照溶液。照TLC法[2010年版《中国药典》（一部）附录ⅥB]试验，吸取上述3种溶液各5 μl分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（40∶5∶10∶0.2，V/V/V/V）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5%香草醛硫酸溶液，加热至斑点显色清晰。结果，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同的蓝紫色荧光斑点。赤芍的TLC图见图3。

2.1.4 当归[5]取本品22 g，加乙醚50 ml，超声（功率：150 W，频率：40 kHz）处理10 min，滤液蒸干，残渣加乙醇1 ml使溶解，作为供试品溶液。取当归对照药材0.5 g，加乙醚20 ml，按上述供试品溶液的制备方法制成对照药材溶液。取缺当归的其余药味制成的阴性对照品22 g，按上述供试品溶液的制备方法制成缺当归的阴性对照溶液。照TLC法[2010年版《中国药典》（一部）附录ⅥB]试验，吸取上述3种溶液各10 μl分别点于同一硅胶G薄层板上，以正己烷-乙酸乙酯（4∶1，V/V）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（365 nm）下检视。结果，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。当归的TLC图见图4。

图3 赤芍的TLC图1～3.供试品；4.赤芍对照药材；5.芍药苷对照品；6.缺赤芍的阴性样品Fig 3 TLC of Paeoniae Radix Rubra1-3.test samples；4.Paeoniae Radix Rubra reference substance；5.peoniflorin control；6.negative control without Paeoniae Radix Rubra

图4 当归的TLC图1～3.供试品；4.当归对照药材；5.缺当归的阴性对照品Fig 4 TLC ofA.sinensis1-3.test samples；4.Angelicae Sinensis Radix reference substance；5.negative control withoutA.sinensis

2.1.5 木香[6]取本品20 g，加甲醇40 ml，用玻璃棒分散，超声（功率：150 W，频率：40 kHz）处理30 min，滤过，取滤液浓缩至2 ml，作为供试品溶液。取木香对照药材0.5 g，加甲醇10 ml，按供试品溶液的制备方法制成对照药材溶液。取缺木香的其余药味制成的阴性对照品0.5 g，按上述供试品溶液的制备方法制成缺木香的阴性对照溶液。照TLC法[2010年版《中国药典》（一部）附录ⅥB]试验，吸取上述3种溶液各5 μl分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-环己烷-甲醇（5∶3∶0.1，V/V/V）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以1%香草醛硫酸溶液，加热至斑点显色清晰。结果，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上显相同颜色的荧光斑点。木香的TLC图见图5。

2.2 大黄素和大黄酚的含量测定[7-8]

2.2.1 色谱条件与系统适用性试验 色谱柱：Boston Green ODS C18（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇-0.1%磷酸溶液（85∶15，V/V）；柱温：25 ℃；检测波长：254 nm。理论板数按大黄素、大黄酚峰计应不低于3 000。

2.2.2 供试品溶液的制备[1]精密称取本品约3 g，置于100 ml锥形瓶中，精密加入甲醇25 ml，称定质量，加热回流提取30 min，放冷，再次精密称定，加甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过。精密量取续滤液10 ml，置圆底烧瓶中，挥干溶剂，加水15 ml使溶解，再加盐酸1 ml，超声（功率：150 W，频率：40 kHz）处理5 min，加热回流提取30 min，立即冷却，置于分液漏斗中。用少量乙醚洗涤容器，洗涤液并入分液漏斗中，用乙醚分3次振摇提取，每次15 ml，合并乙醚液，蒸干。残渣加甲醇使溶解，转移至25 ml量瓶中，加甲醇定容，摇匀，经0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

图5 木香的TLC图1～3.供试品；4.木香对照药材；5.缺木香的阴性对照品Fig 5 TLC ofA.lappa1-3.test samples；4.Aucklandiae Radix reference substance；5.negative control withoutA.lappa

2.2.3 混合对照品溶液的制备 精密称取大黄素、大黄酚对照品各适量，加甲醇制成每1 ml含48.25 μg大黄素和109 μg大黄酚的混合对照品溶液。

2.2.4 阴性样品溶液的制备 按处方比例称取药材，按续骨冲和膏的处方工艺制成缺大黄的阴性样品，再按“2.2.2”项下方法制成缺大黄的阴性样品溶液。

2.2.5 专属性试验 分别精密吸取混合对照品溶液、供试品溶液及阴性样品溶液各20 μl，按“2.2.1”项下色谱条件进样测定。结果，供试品色谱中，在与对照品色谱相应保留时间处，有相同的色谱峰；阴性对照无干扰。色谱见图6。

图6 高效液相色谱图A.供试品；B.混合对照品；C.阴性对照；a.大黄素；b.大黄酚Fig 6 HPLC chromatogramsA.test sample；B.mixed control；C.negative control；a.emodin；b.chrysophanol

2.2.6 线性关系考察 精密量取“2.2.3”项下的混合对照品溶液0.5、1、2、4、8 ml，分别用甲醇稀释，得到系列浓度的混合对照品溶液。分别精密吸取系列对照品溶液各20 μl，按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。以质量浓度（x，μg）为横坐标、峰面积（y）为纵坐标，绘制标准曲线，得大黄素的回归方程为y＝72.876x－30.738（r＝0.999 9），大黄酚的回归方程为y＝62.82x－57.904（r＝0.999 9）。结果表明，大黄素和大黄酚的质量浓度分别在2.41～38.6、5.45～87.2 μg/ml范围内与各自峰面积呈良好线性关系。

2.2.7 精密度试验 精密称取续骨冲和膏（批号：201301202）样品适量，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.2.1”项下色谱条件连续进样5次，记录峰面积。结果，大黄素和大黄酚峰面积的RSD分别为1.3%、1.2%（n＝5），表明仪器精密度良好。

2.2.8 稳定性试验 精密吸取同一批供试品溶液各适量，分别于配制0、2、4、6、8 h时按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果，大黄素和大黄酚峰面积的RSD分别为1.08%、1.53%（n＝5），表明供试品溶液在8 h内稳定性良好。

2.2.9 重复性试验 称取同一批次的续骨冲和膏（批号：201301202）共6份，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积，计算样品含量。结果，大黄素和大黄酚的平均含量分别为0.15、0.33 mg/g，其峰面积的RSD分别为1.2%、1.1%（n＝6），表明该方法重复性良好。

2.2.10 加样回收率试验 精密称取同一批次（批号：201301202）已知含量的续骨冲和膏1 g（约含大黄素0.15 mg、大黄酚0.33 mg），共6份，分别置于磨口锥形瓶中，精密加入混合对照品溶液适量，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积，并计算加样回收率，结果见表1。

表1 加样回收率试验结果（n＝6）Tab 1 Results of recovery tests（n＝6）

2.2.11 样品含量测定 精密称取3批样品各适量，分别按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积，并计算样品含量，结果见表2。

表2 样品含量测定结果（mg/g，n＝3）Tab 2 Results of content determination（mg/g，n＝3）

3 讨论

本制剂中各药味的TLC鉴别试验基本参照2010年版《中国药典》（一部）中有关药味的鉴别方法。其中，大黄、赤芍、当归的TLC鉴别试验方法分别与2010年版《中国药典》方法基本一致。黄柏原采用2010年版《中国药典》中的鉴别条件，以三氯甲烷-甲醇-水（30∶15∶4，V/V/V）的下层溶液为展开剂[2]，结果斑点不清晰；后尝试采用文献方法[3]的乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水（10∶6∶1∶1，V/V/V/V）为展开剂，结果斑点清晰，分离度好。木香原采用2010年版《中国药典》中的鉴别条件，以环己烷-甲酸乙酯-甲酸（15∶5∶1，V/V/V）的上层溶液为展开剂[2]，结果展开效果也很差，后参考文献方法[4]改成三氯甲烷-环己烷-甲醇为展开剂，且经不断调整各试剂比例，直至调整到5∶3∶0.1（V/V/V）时，其展开效果好。由于本制剂是由20味中药组成的复方制剂，成分较为复杂，TLC鉴别过程中对提取方法及展开剂的选择有较高要求，在对处方中骨碎补、续断、防风、红花、蒲黄、独活等其余药味的TLC鉴别研究中，存在图谱斑点不清晰、拖尾、阴性干扰大等缺陷，需进一步研究，暂不列入标准中。

采用HPLC法测定大黄素和大黄酚含量时，供试品溶液的制备方法则参照了有关文献方法，简化了2010年版《中国药典》中大黄含量测定项[2]中配制8%盐酸溶液的步骤，缩短了回流提取时间。参照2010年版《中国药典》（一部）中大黄含量测定项下的色谱条件，以甲醇-0.1%磷酸溶液（75∶25、80∶20、85∶15，V/V）多种比例试验选择流动相，当比例为85∶15时，大黄素和大黄酚的色谱峰分离度适合、基线平直、峰形对称、其余成分无干扰。

综上所述，本研究所建立的方法方便快捷，重现性、专属性好，结果稳定可靠，可作为续骨冲和膏的质量控制方法。

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