培养基组分及操作参数对抗体多聚体形成的影响

王杰　肖政　范里　邓献存　刘旭平　谭文松

摘要：近年来，国家食品药品监督管理局基于药物安全性的考虑对于治疗性蛋白的质量提出了更高的要求，而蛋白多聚体能引起人体免疫反应，被认为是关键质量属性（critical quality attributes，CQA）。采用培养基组分添加试验和操作参数控制试验的方法，系统研究了培养基中氧化还原物质和培养过程参数（温度和pH值）对抗体多聚体形成的影响。结果表明，半胱氨酸的添加能显著抑制多聚体的形成，培养基中半胱氨酸添加浓度增至30 mmol/L，多聚体含量下降40%。而铜离子的添加浓度从500 μmol/L降至0 μmol/L，多聚体含量则降低了43%。培养温度从35 ℃降低至32 ℃，重链结合蛋白（BiP）和蛋白二硫键异构酶（PDI）的表达水平均提高了89%，细胞翻译后修饰能力显著加强，分泌至上清液中的抗体多聚体含量相应下降了38%。研究结果明确了生产工艺和产品关键属性之间的关系，为后续设计优化以质量为先导的培养过程，生产质量可控、安全、有效抗体药物奠定了基础。

关键词：单克隆抗体；多聚体；氧化还原；操作参数；培养基组分

中图分类号：Q943.1 文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）02-0029-04

收稿日期：2014-11-24

基金项目：国家自然科学基金（编号：21106045）。

作者简介：王杰（1987—），女，河北保定人，硕士研究生，研究方向为动物细胞与组织工程。E-mail：ecust12wj@126.com。

通信作者：谭文松，教授，研究方向为动物细胞与组织工程。E-mail：wstan@ecust.edu.cn。21世纪以来，食品药品监督管理局对治疗性蛋白药物安全性和功效性要求不断提高，质量监测和控制成为动物细胞大规模培养过程中的研究热点，美国药物与食品监管局和欧洲药物局于2004年提出了在所有的药物开发生产中补充质量设计（quality by design，QbD）理念[1]。

多聚体含量是蛋白药物关键质量属性（CQA）之一，越来越受到人们的关注。生产过程中形成的蛋白多聚物会影响最终产品安全性和功效性。Rosenberg指出蛋白多聚体是免疫反应的强力诱导者，仅10%的多聚体含量就会引发人的免疫反应，甚至导致人的死亡，因此要严格控制生产过程中多聚体的形成[2]。

蛋白多聚体是通过共价键（例如二硫键），或者非共价键（静电作用和疏水作用）的连接形成的[3]。抗体二硫键连接发生在内质网中，内质网的氧化还原电势将直接影响到抗体二硫键的连接。培养过程中的控制参数（pH值和温度）已被广泛证明会影响细胞生理状态，影响抗体表达，折叠和翻译后修饰，Yoon 等报道，降低培养温度至33.5 ℃，使EPO的比生成速率提高了4倍，使EPO的产量提高了2.4倍[4]。Muthing等报道pH值影响了杂交瘤细胞表达的单克隆抗体的半乳糖和唾液酸的含量[5]。抗体分泌到胞外后已正确连接的二硫键又会被氧化还原物质还原和重构，形成蛋白多聚体[6]。而为防止因活性氧（reactive oxygen species，ROS）引起的细胞凋亡，培养基中一般均会添加谷胱甘肽、N-乙酰半胱氨酸等还原物质，这可能会加速蛋白多聚体的形成。基于QbD理念基础，亟须研究培养过程参数及培养基组成对蛋白多聚体形成的影响，深入理解多聚体和生产工艺之间的联系，建立多聚体与过程参数的关系，从而减少最终产品多聚体含量，保证实现质量设计。

我们采用培养基组分添加试验和操作参数控制试验的方法，系统研究了培养基中氧化还原物质和培养过程参数（温度和pH值）对抗体多聚体形成的影响。研究结果为后续在质量设计（QbD）指导下进行工艺开发提供了数据支持，为建立质量可控的培养工艺奠定了基础。

1材料与方法

1.1细胞株与培养基

试验所用细胞株为表达单克隆抗体-A（Mab-A）的CHO细胞。

基础培养基和流加培养基均由华东理工大学生物反应器国家重点实验室自主研发，其中流加培养基由多种氨基酸、维生素以及葡萄糖组成。

1.2培养基组分添加试验

培养基组分添加试验分为2组：还原组分添加试验和氧化组分添加试验。还原组分添加试验中，选取了5个常用还原剂谷胱甘肽（GSH）、二巯基苏糖醇（DDT）、β-巯基乙醇（β-mercaptoethanol）、维生素C以及半胱氨酸（cysteine），具体添加浓度见表1，其中试验组6为未添加上述还原剂的阴性对照。试验组1～5设定的添加浓度均为基础培养基添加浓度的3～10倍。氧化组分添加试验选取了CuSO4和胱氨酸这2种氧化剂（表1）。添加Cu2+试验中添加了不同浓度的铜离子，未添加铜离子作为阴性对照组。添加胱氨酸试验中的对照未添加胱氨酸。

培养基组分添加试验采用流加培养方式考察上述培养基添加组分对最终产品多聚体含量的影响。流加培养的具体操作方式如下：将细胞以1×106 个/mL的密度接种于500 mL（Corning，USA）摇瓶内，工作体积为150 mL，置于偏转半径为20 mm的摇床上培养，转速设置为110 r/min，培养箱条件设置为7%的CO2浓度和37 ℃的温度。每天脉冲2%（体积分数）的流加培养基以补充因细胞生长及产物合成所损耗的营养物。

1.3操作参数控制试验

操作参数控制试验主要考察培养温度和pH值对最终产品多聚体含量的影响，分为温度控制试验和pH值控制试验2部分内容。温度控制试验选取32.0、33.5、35 ℃ 3个水平，每个水平做4个平行，33.5 ℃为对照组；pH值控制试验选取68、7.0、7.2等3个水平，每个水平做3个平行，pH值7.0为对照组。操作参数控制试验均在2 L生物反应器上进行，采用的培养模式为流加培养，具体操作如下：接种细胞密度为1×106 个/mL，工作体积为2 L，搅拌转速设置为80 r/min，溶氧为40%，pH值采用补加CO2或NaOH控制，温度和pH值参数设置如上所述。

1.4分析方法

1.4.1多聚体含量检测凝胶排阻色谱（SEC）是检测单克隆抗体中多聚体含量的通用方法，本方法使用的高效液相系统为Waters 2487 HPLC System （1525 Binary HPLC Pump；717 plus Autosampler；2487 UV Detector，Waters），采用的色谱柱是孔径为4 μm的TSK-Gel G3000 SWXL （4.6 mm×30 cm，Tosoh Bioscience，Montgomery，PA） 色谱柱。流动相为 20 mmol/L 磷酸二氢钠、0.2 mol/L氯化钠缓冲溶液。进样量为20 μl，检测波长为280 nm，以0.5 mL/min的流速等度洗脱30 min。

1.4.2BiP mRNA和PDI mRNA相对含量检测BiP和蛋白二硫键异构酶（protein disulfide isomerase，PDI）是抗体蛋白翻译后修饰过程中2个重要的分子伴侣蛋白，直接参与蛋白二硫键的形成。BiP mRNA和PDI mRNA含量能间接反映内质网中二硫键加工能力。BiP mRNA和PDI mRNA含量通过荧光定量 PCR 测定，以β-actin为内参基因，BiP mRNA和PDI mRNA的相对含量由公式（1）计算得到：

X=Xi/Xstd×100%。（1）

式中：X为BiP mRNA或PDI mRNA相对含量，Xi为BiP mRNA或PDI mRNA的含量，Xstd为β-actin mRNA的含量。

2结果与分析

2.1培养基组分对多聚体形成的影响

2.1.1还原组分对多聚体形成的影响还原组分添加试验的检测结果见表2。半胱氨酸是对多聚体形成影响极显著（P<0.000 1）。培养基中添加了30 mmol/L的半胱氨酸后，抗体多聚体相对百分含量下降至62%，比对照组下降了近40%。半胱氨酸是氨基酸中唯一一个带有游离巯基的氨基酸，该游离巯基被认为可以参与蛋白中二硫键的交换和还原。Banks等用半胱氨酸对半胱氨酸化水平有差异的抗体进行孵育，发现半胱氨酸不仅能够去除抗体的半胱氨酸化，而且能够减少抗体中多聚体含量，提高抗体稳定性[7]。抗体分子处于铰链区二硫键溶剂暴露性最差，一方面易相互交换形成多聚体，另一方面也容易受游离巯基的攻击而发生解离。因此，半胱氨酸的加入可能攻击了抗体铰链区的二硫键的连接，加速了这部分二硫键的还原，促使多聚体转变为单体，从而显著减少了多聚体含量。谷胱甘肽、二巯基苏糖醇、β-巯基乙醇、维生素C在试验组考察的范围内对多聚体的形成与对照差异不显著。

2.1.2氧化组分对多聚体形成的影响铜离子不仅是具有强氧化性的化学物，而且会影响线粒体、内质网等重要细胞器的生理功能。铜离子添加浓度对多聚体含量的影响见图1。铜离子添加浓度与多聚体含量呈正相关。对照组多聚体的含量为9%，添加25 μmol/L铜离子后，多聚体含量达到108%，比对照增加了20%，添加500 μmol/L铜离子后，多聚体含量最高，达15.8%，比对照增加了76%。Chaderjian等发现培养基中加入Cu2+离子后，CHO细胞表达的IgG1的Fab片段上的自由巯基含量显著减少，说明铜离子在胞内介导了内质网内蛋白质的合成过程[8]。Cromwell等认为金属离子会造成蛋白表面局部变性，改变蛋白表面物化特性，增加蛋白聚合的概率[9]。我们推测铜离子一方面影响了内质网内的氧化还原电势，另一方面引起了培养上清中抗体表面的变性，使某含量（%）1谷胱甘肽150 μmol/L105±3.43300 μmol/L106±1.892β-巯基乙醇4 mg/L97±2.3212 mg/L98±1.653二巯基异糖醇500 μmol/L103±2.451 mmol/L97±2.124维生素C0.1 mmol/L97±2.640.4 mmol/L98±1.175半胱氨酸30 mmol/L62±1.23***6对照～100±3.54注：计算公式为C=Ci/Ccon×100%，式中：Ci表示条件i下的多聚体百分含量，Ccon表示对照组的多聚体百分含量，C代表条件i下多聚体的相对百分含量。以上所有数值格式均为“平均值±标准偏差”（n=3）。***表示P<0.000 1。

些二硫键溶剂暴露性增大，增加了分子间二硫键错配交联的几率，从而导致了二硫键的形成。

在基础培养基中加入胱氨酸后，产物中多聚体的相对百分含量见表3，添加27 mmol/L胱氨酸使多聚体相对百分含量达到103%，比对照仅增加了3%，与对照处于同一水平。表明，胱氨酸的加入对多聚体的形成并没产生影响。

2.2培养过程参数对多聚体形成的影响

2.2.1温度对多聚体形成的影响温度是影响细胞代谢和表达的重要参数，Schatz等将CHO细胞培养温度降低至 28 ℃，最终抗体的产量提高了38倍[10]。Trummer等将培养温度降低至 30 ℃时，CHO细胞表达的EPO的唾液酸含量降低了40%[11]。温度被认为是培养过程中最重要的关键操作参数之一。培养温度的降低能显著降低抗体多聚体的含量（图2）。培养温度从35 ℃降低至32 ℃时，蛋白多聚体含量从（6.8±0.38）%减少至（4.2±0.67）%，降低了38%。这与 Rodriguez 等在研究温度对β-IFN蛋白分泌影响的结论[12]一致。Wyeth也阐述了降温操作对降低抗体蛋白多聚体含量的重要性[13]。但Gomez却发现33 ℃比37 ℃下抗体的多聚体含量增加4倍到12倍之多[14]，这可能与不同细胞蛋白合成能力和蛋白翻译后修饰能力的平衡有关。

我们从蛋白合成能力和蛋白翻译后修饰能力2个角度深入探讨降温操作对多聚体含量的影响。抗体比生成速率直接反映了细胞蛋白合成的能力。将每天的抗体产量对IVCC作图，斜率即为抗体比生成速率。不同温度条件下Mab-A的比生成速率见图3，35 ℃条件下抗体的比生成速率为 （12.58±0.15）×10-9 g/（cell·day），32 ℃条件下的比生成速率提高到（20.83±0.34）×10-9 g/（cell·d），比35 ℃增加了0.66倍，可见降温操作能有效提高细胞蛋白合成能力。我们采用荧光定量PCR的方法检测了直接参与二硫键连接的2个重要蛋白BiP和PDI的转录水平（图4），这2个蛋白转录水平的高低反映了蛋白翻译后修饰能力的强弱。低温培养能显著提高BiP和PDI 的表达水平。与35 ℃相比，CHO细胞在32 ℃条件下培养时BiP和PDI的表达水平均提高了89%。Kou等在研究培养温度对TNFR-Fc产物比生成速率的影响机制时发现，降低温度后，虽然两者的mRNA表达水平一致，但30 ℃时内质网内分子伴侣PDI和Bip的表达量却是37 ℃下的1.8倍，蛋白翻译后修饰能力提高了2倍[15]。我们推测温度的降低虽然同时提高蛋白合成能力和蛋白翻译后修饰能力，但蛋白翻译后修饰能力的提高高于蛋白合成能力的提高程度，最终获得的抗体蛋白多聚体含量显著降低。