不同真菌发酵对花生秸秆发酵产物营养指标及水解效率的影响

王雷雷，冯 晋，余中华,3，刘家扬,3，李恩中,3，蒋金锋

（1.黄淮学院生物工程系，河南 驻马店 463000；2.驻马店市畜牧局，河南 驻马店 463000；3.黄淮学院发酵工程实验教学示范中心，河南 驻马店463000；4.正阳县新天地草业有限公司，河南 驻马店 463000）



不同真菌发酵对花生秸秆发酵产物营养指标及水解效率的影响

王雷雷1，冯 晋2，余中华1,3，刘家扬1,3，李恩中1,3，蒋金锋4

（1.黄淮学院生物工程系，河南 驻马店 463000；2.驻马店市畜牧局，河南 驻马店 463000；3.黄淮学院发酵工程实验教学示范中心，河南 驻马店463000；4.正阳县新天地草业有限公司，河南 驻马店 463000）

摘 要：以花生秸秆为材料，采用从驻马店置地公园分离得到的6种大型真菌进行固态发酵，对发酵产物中粗蛋白、粗脂肪、粗纤维和粗灰分等营养成分的含量以及发酵产物在纤维素酶作用下的水解效率进行了测定。结果表明，与对照相比，菌株L3、L4和L11可以提高产物粗蛋白含量，增幅达30％以上；L11和L3菌株分别使粗脂肪含量提高了1.4和0.4个百分点；真菌PG处理花生秸秆后提高了产物粗纤维的相对含量（约10 ％），其他菌株则降低了粗纤维的含量；花生秸秆中粗灰分的含量在真菌处理后都明显降低，平均降幅达50％。不同pH值的缓冲液以及不同量的酶，都会影响花生秸秆的水解效率；当缓冲液pH值为5.4，酶量为6.1 U/g秸秆时，L11处理的花生秸秆水解效率最高，达到50％。

关键词：花生秸秆；真菌；固体发酵；营养指标；水解效率

我国是一个农业大国，养殖业在其中扮演着重要角色。近年来，为了发展节粮型畜牧养殖业，避免出现人畜争粮的局面，各单位利用秸秆积极开发非常规饲料。对秸秆等的重复利用意义重大，一方面可增加家畜的饲料来源，降低养殖业的成本，增加农民收入；另一方面还可避免秸秆焚烧带来的环境污染，有利于农业的可持续发展[1]。目前，以玉米秸秆[2-4]、高粱秸秆[5]、麦麸[6]等为材料发酵研制动物饲料的报道较多，但以花生秸秆为材料的报道较少。

花生是我国北方地区的主要油料作物，其秸秆的年产量约2 700万～3 000万 t/a[7]，是一种供应量巨大的纤维素预混料来源。目前，对花生秸秆等农业废弃物的利用率很低，大部分被就地焚烧，造成极大的资源浪费和环境污染[8-9]。而且，花生秸秆中富含纤维素、半纤维素及木质素等成分，直接作为动物饲料时，其被动物消化利用的效率较低。有研究称，利用真菌固态发酵技术预处理植物类废弃物，可将其转化为方便动物摄取的饲料，但处理效果受到真菌及原材料种类的影响[10]。因此，研究以花生秸秆为材料，通过不同真菌发酵处理，分析发酵产物的营养价值和水解效率，以期为秸秆饲料的开发利用提供依据。

1　材料与方法

1.1试验材料

1.1.1花生秸秆 新鲜花生秸秆：2013年10月取自驻马店市驿城区郊区农田，用自来水冲洗表面可溶性物质，并在60℃条件下烘干48 h，然后剪成大约2cm长度备用。

1.1.2真菌菌株 采自驻马店市驿城区置地公园不同真菌的子实体，经分离纯化后获得：L2、L4、L9和L11，尚未进行分子鉴定；平菇真菌（简称PG）购于当地超市；L3为生产胞外漆酶的血红密孔菌[11]。

1.1.3培养基 马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基：马铃薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，琼脂20 g/L，pH值自然。

1.1.4主要试剂和仪器 试验主要试剂有3,5-二硝基水杨酸、氢氧化钠、酒石酸钾钠、苯酚、亚硫酸钠等（国产分析纯）和中性纤维素酶（河南仰韶生化工程有限公司）。主要仪器有DHG-924OA型鼓风干燥箱（常州诺基仪器）、111二两高速中药粉碎机（瑞安市永历制造）、LHS-150H恒温恒湿培养箱（郑州生元仪器）、LDZM-50KCS立式压力蒸汽灭菌器（上海申安医疗器械）和INESA可见分光光度计（上海仪电分析仪器）。

1.2试验方法

1.2.1菌种培养、活化与制备 菌体培养：将采摘的5种菌体分别在无菌条件下取菌丝，接种到PDA培养基上，30℃培养5～7 d，再将菌丝转接新鲜平板获得纯培养。菌种活化：将4℃冰箱保存的纯菌种L3转接到PDA培养基上，30℃培养5～7 d。

1.2.2花生秸秆的固态发酵 分别从已活化的PDA培养基上取2～3块0.5 cm×0.5 cm大小的菌种块，接种到灭菌后的花生秸秆培养基（121℃，20 min，含水量约30 ％，花生秸秆为唯一培养基成分），32℃培养10 d，完成秸秆的真菌预处理。以不发酵的花生秸秆为对照（control）。

1.2.3发酵产物胞外漆酶提取与测定取长满菌体的花生秸秆加入蒸馏水，水量以全部淹没花生秸秆为宜，浸泡2 h，然后抽提液体，通过2,6-二甲氧基苯酚（DMP）法测定液体中胞外漆酶活力[12]，以U/g花生杆表示。

1.2.4发酵产物营养指标测定 将剩余的固体样品，放入鼓风干燥箱内，60℃烘48 h，将烘干的花生秸秆放入粉碎机内粉碎30 s，过40目筛，最后分装入广口瓶，贴上标签备用。采用半微量凯氏定氮法[13]、索式提取法[11]、植物类食品中粗纤维的测定方法[14]和饲料中粗灰分的测定方法[15]分别测定固体样品中粗蛋白、粗脂肪、粗纤维和粗灰分的含量。

1.2.5不同条件下发酵后固体样品纤维素水解效率的测定 分别称取0.2 g发酵后的固体样品于3支25 mL比色管中，加入1.5 mL的缓冲液（pH=5.4或pH=7.0），置于50 ℃水浴锅中平衡10 min，然后依次在3支试管中加入2.3 U/g花生杆、4.6 U/g花生杆和6.1 U/g花生杆的中性纤维素酶，再分别加入5 mL蒸馏水；电磁振荡3～5 s，再置于50℃水浴锅中保温60 min，然后加入2.0 mL DNS试剂，在沸水浴中煮沸5 min，冷却至室温，用蒸馏水定容至25 mL；在波长540 nm处测定吸光度，通过葡萄糖溶液标准曲线方程，计算花生秸秆在pH值为5.4与7.0的缓冲液与不同酶量条件下，释放出还原糖的量（mg/mL）。水解效率（％）=还原糖的量/花生秸秆的量。每个试验做3个平行，计算其平均值和标准差。

1.2.6葡糖糖标准曲线绘制 采用二硝基水杨酸比色定糖法（DNS）测定酶解产物的还原糖的含量[16]，绘制葡萄糖标准曲线。分别用pH值5.4和7.0的柠檬酸缓冲液配制成不同浓度的葡萄糖溶液，在波长540 nm处测定吸光度，以吸光度为横坐标，葡萄糖标准溶液浓度为纵坐标绘制标准曲线，如图1所示。

图1　不同缓冲液下的葡萄糖标准曲线（a，pH=5.4；b，pH=7.0）

2　结果与分析

2.1不同真菌发酵对花生秸秆中营养指标的影响

2.1.1粗蛋白 粗蛋白质是常规饲料分析中的一项重要指标。由图2可知，原始花生秸秆（control）中粗蛋白含量为5.8％，5个菌株（L2, L3, L4, L11, PG）发酵处理的花生秸秆，粗蛋白的含量均有一定变化，尤其是L3菌株处理的花生秸秆，其粗蛋白含量增加至8.2％左右，较对照组提高了约41％；另外，L4和L11菌种处理的花生秸秆，其粗蛋白含量增加至7.6％左右；只有L9菌种处理的花生秸秆中粗蛋白含量不增反减，约比对照组低17％。由此可见，经真菌处理的花生杆，在粗蛋白的含量上存在明显差异。

图2　不同真菌发酵后花生秸秆中粗蛋白含量的变化

2.1.2粗脂肪 粗脂肪是一种高热值营养成分，虽然动物对其需要量不高，但亦不能缺少，其在提高饲料的适口性、加快动物增重速度和饲料的利用率等方面发挥了重要作用。从图3中可以看出，经L2、L9和PG菌株处理的花生秸秆，其粗脂肪的含量低于对照组。这说明这3个菌种在发酵花生秸秆时，需要从花生秸秆中吸收利用粗脂肪。而L11和L3菌种处理的花生秸秆粗脂肪含量分别比对照提高1.4和0.4个百分点。由此可知，不同真菌发酵对花生秸秆粗脂肪含量的影响存在明显差异。

图3　不同真菌发酵后花生秸秆中粗脂肪含量的变化

2.1.3粗纤维 纤维广泛存在于植物体内，是植物食品的主要成分之一，它们能促进动物胃肠道蠕动，改善消化系统机能，还能被动物消化吸收，提供能量来源。如图4所示，原始花生秸秆中的粗纤维含量为43.8％，真菌发酵后其含量有轻微的变化。PG处理的花生秸秆中粗纤维的含量比对照提高了5.9个百分点，L2、L3、L4、L9和L11处理的花生秸秆粗纤维分别比对照降低6.4、4.7、3.9、0.6和5.8个百分点。这表明在固态发酵过程中，真菌会降解秸秆中的木质素及纤维素，但不同真菌对木质纤维素的降解能力不同[17]。

2.1.4粗灰分 饲料常规检测中的粗灰分是指经高温灼烧后的残留物质。粗灰分的含量是评价营养成分的参考指标，其中含有大量矿物质，具有调节机体生理机能的作用。如图5所示，固体发酵后花生秸秆中的粗灰分都比对照低，平均降幅达50％。这是因为真菌在花生秸秆上生长，会利用所产酶系将部分木质纤维素降解，转化为自身组成部分；同时，真菌还会将一些水不溶性的矿物质释放出来，进入胞外酶液中，导致真菌处理后的固体样品中的粗灰分含量明显降低。不同菌种处理的花生秸秆，粗灰分含量表现出一定差异，这说明不同菌种对花生秸秆的利用程度不一致。

图4　不同真菌发酵后花生秸秆中粗纤维含量的变化

图5　不同真菌发酵后花生秸秆中粗灰分含量的变化

2.2不同条件对发酵后固体样品纤维素水解效率的影响

采用不同pH值的缓冲溶液，加入不同量的酶，测定花生秸秆纤维素的水解效率，结果如图6所示。经菌种处理后的花生秸秆，水解出的糖含量有较为明显的差异。当缓冲液pH值为5.4时（图6a），L11菌种处理的花生秸秆纤维素水解效率最高，酶量为6.1 U/g秸秆时，纤维素水解效率高达50％；当缓冲液pH值为7.0时（图6b），L2菌种处理的花生秸秆纤维素水解效率最高，比对照组提高约10个百分点。由此可知，真菌发酵处理后，花生秸秆的纤维素水解效率明显提高，但菌种之间有一定差异。

2.3不同真菌发酵对胞外漆酶分泌的影响

在花生秸秆固体发酵过程中，真菌能分泌胞外酶蛋白，主要包括木质素降解酶系和纤维素降解酶系，其中木质素降解酶系包括漆酶、木质素过氧化物酶及锰过氧化物酶。通过对胞外漆酶的测定发现（图7），不同真菌分泌漆酶的能力不同；其中，以L9和L3分泌能力最高，发酵液中漆酶活力分别达到2 U/g与1.6 U/g；而PG、L4和L2分泌的胞外漆酶较少，活力均低于1 U/g；菌株L11几乎不分泌胞外漆酶。有研究表明，漆酶是真菌降解植物类材料木质素的关键酶[18]。

图6　不同缓冲液条件下各真菌对花生秸秆的水解效率（a，pH=5.4；b，pH=7.0）

图7　不同真菌发酵对胞外漆酶分泌的影响

3　结论与讨论

试验结果表明，不同真菌处理的花生秸秆，其营养指标存在差异。与对照相比，菌株L3、L4和L11可以提高产物粗蛋白含量，增幅达30％以上；L11和L3菌株分别使粗脂肪含量提高了1.4和0.4个百分点；真菌PG处理花生秸秆后提高了产物粗纤维的相对含量（约10 ％），其他菌株则降低了粗纤维的含量；花生秸秆中粗灰分的含量在真菌处理后都明显降低，平均降幅达50％。在水解效率方面，不同pH值的缓冲液以及不同量的酶，都会影响花生秸秆的水解效率，当缓冲液pH值为5.4，酶量为6.1 U/g秸秆时，L11处理的花生秸秆水解效率最高，达到50％。生产实践中，需根据菌株的特性，选择一种或多种菌株同时处理花生秸秆，以提高秸秆饲料的利用率。

纤维素类物质是地球上最为丰富的再生资源，花生秸秆中含有较高的纤维素，找到切实可行的方法处理花生秸秆，是提高纤维素利用率的关键。真菌是自然界中降解木质纤维类物质最有效的微生物[18]。试验结果表明，6种不同真菌对花生秸秆进行固体发酵，发酵产物中的营养成分发生了明显变化，同时水解效率和胞外酶的分泌能力也得到了不同程度的提升。

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（责任编辑：成 平）

Nutritive Value and Hydrolysis Efficiency of Fungi Fermented Peanut Straw’s Products

WANG Lei-lei1，FENG Jin2，YU Zhong-hua1,3，LIU Jia-yang1,3，LI En-zhong1,3，JIANG Jin-feng4
（1.Department of Bioengineering, Huanghuai University, Zhumadian 463000, PRC; 2.Animal Husbandry Bureau of Zhumadian City, Zhumadian 463000, PRC; 3.Experiment and Teaching Demonstration Center for Fermentation Engineering, Huanghuai University,Zhumadian 463000, PRC; 4.Zhengyang Xintiandi Grass Industry Co., Ltd., Zhumadian 463000, PRC）

Abstract：This study was conducted to determ ine the fungal solid fermentation effects on crude protein, fat, cellulose and ash content as well as the subsequent cellulase-acted hydrolysis efficiency of peanut straw fermented w ith 6 kinds of fungi isolated from Zhidi Garden in Zhumadian.The results showed that the fungus L3, L4 and L11 could increace the crude protein content by 30％, the L11 and L3 increased the crude fat content by 1.4 and 0.4 percentage points, respectively, as compared w ith the control; the PG-treated straw had a higher crude cellulose content by 10％ than the control while other treatments lowered the cellulose content; and all the treatments were found to decrease the crude ash content by 50％ averagely.The enzymatic hydrolysis efficiency of the peanut straw could be influenced w ith pH values and enzyme dosages; and the L11 treatment led to the highest hydrolysis efficiency of approximately 50％ when exposed to the cellulase dosage at 6.1 U/g straw and the buffer solution at pH 5.4.

Key words：peanut straw; fungus; solid fermentation; nutritive value; hydrolysis efficiency

中图分类号：S816.6

文献标识码：A

文章编号：1006-060X（2015）12-0001-04

通讯作者：余中华，刘家扬

作者简介：王雷雷（1992-），男，河南登封市人，硕士研究生，主要从事发酵饲料方面的研究。

基金项目：黄淮学院青年教师科研能力提升计划项目（201512703）

收稿日期：2015-07-18

DOI:10.16498/j.cnki.hnnykx.2015.12.001