牛乳铁蛋白抗体的制备及其特性测定

李亚璞，刘玲君，宋晓青，吴 萌，程 华，李春生（.河北省科学院生物研究所，河北 石家庄 05008；.河北三元食品有限公司，河北石家庄 050073）



牛乳铁蛋白抗体的制备及其特性测定

李亚璞1，刘玲君2，宋晓青2，吴 萌1，程 华1，李春生1
（1.河北省科学院生物研究所，河北 石家庄 050081；2.河北三元食品有限公司，河北石家庄 050073）

摘 要：利用BLF抗原免疫BALB/c小鼠，采用常规细胞融合技术制备了6株抗BLF的单克隆抗体细胞株，并用此抗原免疫新西兰大白兔获得了55 mL的兔多抗血清。针对腹水单抗及多抗血清进行了一系列特性分析，结果显示，5株抗体效价基本上在1∶106以上；间接ELISA测定6株抗体与酪蛋白、乳白蛋白和β-乳球蛋白基本无交叉反应，抗体特异性良好；抗体为IgG1亚类，2B12抗体亲和力优于其他抗体。多抗血清效价可达到1∶107以上，抗体也具有一定的特异性。

关键词：牛乳铁蛋白；单克隆抗体；多克隆抗体；特性

乳铁蛋白（lactoferrin，简称LF）是乳汁中一种重要的非血红素铁结合糖蛋白，分子量为80 kDa[1]。LF是人乳中的4种主要蛋白质之一，约占人乳总蛋白的20％，人乳与牛乳在初乳期LF的含量最高，而到常乳期降到最低。在常乳期，牛乳中LF含量较母乳低很多。LF具有抗菌抑菌性[2-3]、抗病毒[4]、促进铁元素的吸收和铁的平衡[5]、抑制肿瘤细胞生长及调节机体免疫反应[6-7]等多种生理功能。在婴幼儿配方奶粉中强化LF使营养成分接近母乳，对婴幼儿的营养需求和生长发育极其重要，因此在奶粉中添加牛乳铁蛋白（简称BLF）是当今发展的趋势。

BLF的检测方法主要有高效液相色谱法、电泳法和酶联免疫吸附法[8-10]。高效液相色谱法是目前国内测定BLF使用最多，也最权威的方法，但检测成本高；电泳法结果准确，但是检测时间长，操作繁琐。酶联免疫吸附法可用于大规模样品的检测和筛选，为适应现代检测快速、简捷、现场化的要求，也是国际认可的检测BLF的方法之一。试验通过细胞融合技术，免疫小鼠制备了6株抗BLF的单克隆抗体，免疫新西兰大白兔制备了抗BLF的多克隆抗体，为开发BLF双抗体夹心的免疫检测试剂盒奠定了基础。

1　材料与方法

1.1试验材料

供试动物为BALB/c小鼠、新西兰大白兔，均购自河北医科大学实验动物中心。

试验试剂主要有牛乳铁蛋白标准品，纯度98％，日本进口分装；DMEM培养基（GIBCO公司）；HRP标记山羊抗小鼠IgG、山羊抗兔IgG购自北京；新生牛血清购自兰州；乳白蛋白、β-乳球蛋白、HAT、HT、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、PEG4000、免疫球蛋白亚型试剂盒、牛血清白蛋白、鸡卵清白蛋白、甘油、吐温-20等（Sigma公司）。

1.2试验方法

1.2.1抗原的制备 在天平上准确称取BLF标准品10 mg，溶于10 mL超纯水中，150 μL/管进行分装，-20℃储存备用。

1.2.2动物免疫 （1）小鼠免疫：选取3只6～8周龄的雌性BALB/c小鼠，将BLF抗原用生理盐水稀释，加入等体积的佐剂进行乳化，颈背部皮下多点注射，免疫抗原量为50 μg/只，首次免疫用弗氏完全佐剂，以后的免疫用弗氏不完全佐剂，每隔2周加强免疫一次，3次免疫后10 d断尾取血，间接ELISA检测小鼠血清抗体效价，选取最佳免疫小鼠进行融合。（2）新西兰大白兔免疫：免疫新西兰大白兔1只，免疫剂量500 μg/只，3次免疫后耳缘静脉取血，离心取上清液初步测定抗血清效价，然后接着进行第4次和第5次免疫，测定血清效价有无变化，若无变化即可取血，所得血清即为抗BLF多克隆抗体。

1.2.3血清效价测定 常规间接ELISA法测定血清效价：①包被：用包被缓冲液将BLF抗原稀释为1 μg/ mL，然后向每个酶标板孔中加入100 μL抗原液，4℃放置酶标板，过夜。②取出所用数量的酶标板条，洗涤甩干后，加入封闭液，200 μL/孔，37℃温箱避光孵育2 h。③洗板后加入待测血清：用洗液将待测血清倍比稀释成1∶200、1∶400，共计稀释23孔，最后1孔加入洗液作为空白对照，每孔中加入100 μL样品，置于温箱孵育45 min。④洗板后加入用封闭液稀释的HRP标记的山羊抗小鼠IgG，每孔中加入100 μL酶标二抗，温箱中孵育30 min。⑤洗板后加入底物显色液，每孔中加入100 μL显色液，温箱中孵育10～15 min。⑥每孔50 μL加入2 mol/L H2SO4，终止反应。⑦在酶标仪下读数，检测波长450 nm，检测孔OD值记为P，对照孔OD值记为N，以P/N≥2.1作为待测血清的效价。

1.2.4细胞融合 选取免疫效果及状态最佳的小鼠进行细胞融合，采用小鼠体内诱生腹水的方法，制备腹水抗体。

1.2.5抗体的纯化 单抗腹水采用辛酸-硫酸铵法进行纯化，多抗血清采用饱和硫酸铵法进行纯化，蛋白浓度测定采用ND-2000微量紫外分光光度计进行测定。

1.2.6抗体的特性测定 采用间接ELISA方法测定抗体效价，抗体亚型使用抗体亚型测定试剂盒进行测定，抗体的亲和力测定参考文献[11]。将包被抗原换为乳中其他几种主要蛋白：酪蛋白、乳白蛋白及β-乳球蛋白包被酶标板，间接ELISA方法进行免疫交叉测定。

1.2.7多克隆抗体的特性测定 多克隆抗体的特性测定主要包括抗体的效价测定及抗体的特异性测定。

2　结果与分析

2.1免疫小鼠血清效价测定

间接ELISA方法测定结果如表1，1号小鼠的效价为1∶8.2×105，2号小鼠和3号小鼠的效价均为1∶4.1×105，并且1号小鼠的状态活泼，因此试验选取1号小鼠准备细胞融合。

表1　免疫小鼠效价测定

2.2抗BLF单克隆抗体细胞株的建立及抗体的制备

细胞融合约7 d，在显微镜下观察具有克隆的孔达到了292孔，融合率为76％，并将这些克隆孔的培养上清采用间接ELISA方法进行了测定，从中选取了15孔OD值较高并且细胞状态较好的单克隆孔进行了多次亚克隆筛选，最终得到了3A5、3H3、2B11、2B12、2E2和3D7共计6株能够稳定分泌抗体的单克隆细胞株，并对这些细胞株进行了扩大培养和液氮冻存。采用小鼠体内诱生腹水的方法，对6株细胞株进行了抗体的制备，最后每株细胞均得到了约20 mL的腹水抗体。

2.3单克隆抗体的特性测定

2.3.1单克隆抗体的效价及特异性测定 分别以BLF标准品、酪蛋白、乳白蛋白及β-乳球蛋白包被酶标板，包被浓度1 μg/mL，第1孔抗体以1∶200进行，之后依次进行倍比稀释，共计稀释11孔，最后1孔空白对照。3A5、2B11、2B12和3D7四株抗体效价为1∶6.6×106，2E2抗体效价为1∶8.2×105，3H3抗体效价为1∶1.6×106，而6株抗体与其他几种蛋白基本上无交叉反应，特异性良好。

2.3.2单克隆抗体的亚型测定 对6株抗BLF抗体进行亚型测定如图1，测定数据显示6株抗体与IgG1反应较大，OD450值均在3.0以上，与IgM有较微弱的反应，而与IgG2a、gG2b、IgG3和IgA基本上无反应，因此该6种抗体亚型均为IgG1型。

2.3.3单抗的相对亲和力测定 根据公式计算6株单抗的相对亲和力测定结果为：2B12>3H3>2B11>3A5> 3D7>2E2。

2.3.4抗体的纯化 采用辛酸-硫酸铵法对腹水进行纯化，经过纯化后3H3、3A5、2B11、2B12、2E2和3D7共6株抗体的蛋白浓度分别为9.83、10.28、6.72、12.53、7.41和10.95 mg/mL。

图1　单克隆抗体亚型测定

2.3.5多克隆抗体的特性测定 经过5次免疫，采血，经过离心约得55 mL多抗血清。间接ELISA法测定兔多抗血清的效价结果如表2显示，BLF抗原对新西兰大白兔的免疫效果很好，免疫效价达到了1∶1.3×107。间接ELISA法测定兔多抗的交叉反应如所示，分别为酪蛋白、乳白蛋白和β-乳球蛋白包被，由图1可知该多抗血清与其他3种蛋白有较微弱的交叉反应，该多抗血清具有一定的特异性。将多抗血清经过饱和硫酸铵法纯化后冻干，部分冻干粉经过稀释测定蛋白浓度为50 mg/mL，分装备用。

表2　兔多抗血清特异性测定

3　结果与分析

试验抗原为大分子蛋白，因此选择了常规免疫方法，经过3次免疫后，供试小鼠及新西兰大白兔的免疫效果达到了1∶106以上，然后又分别对其进行了加强免疫，最后得到了效价很高的抗BLF的单抗血清及多抗血清。

影响细胞融合效果的因素很多，如SP2/0细胞的生长状况、SP2/0细胞与小鼠免疫脾细胞的比例等。其中，SP2/0细胞株是细胞融合成功的关键之一，试验选择的SP2/0细胞是处于对数生长期的细胞，这时细胞活性最强，生命最旺盛，大小均一、浑圆透亮。免疫脾细胞与SP2/0细胞的比例一般是8∶1到10∶1之间融合效率比较高。试验按8∶1进行融合，细胞融合率达到了76％。细胞融合后要及早进行抗体检测和克隆化培养，经过大约7～9 d，通过显微镜观察，若细胞集落生长到整个视野的1/5～1/3时，就可以进行检测。在进行亚克隆筛选的过程中，应同时进行培养上清的交叉反应测定，这样就可以保证筛选所得的细胞所产生的抗体具有一定的特异性。试验经过4次亚克隆筛选，得到了6株能稳定分泌抗体且质量好的抗BLF的单克隆抗体细胞株，分别为3H3、3A5、2B11、2B12、2E2和3D7。综合比较，以2B12抗体亲和力最高，因此选取其用于下一步的双抗体夹心试验。

多抗血清的效价及其特异性主要取决于抗原的纯度。试验所用BLF抗原标准品为日本进口分装，抗原纯度在98％以上，因此保证了所获得抗血清的特异性。试验对该多抗血清进行了饱和硫酸铵纯化，所获抗体蛋白浓度为50 mg/mL，交叉反应测定结果显示，该抗体与牛乳中其他主要蛋白有微弱的交叉反应，可用于以后的双抗体夹心试验。

参考文献：

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（责任编辑：夏亚男）

Preparation and Characteristics of Antibodys against Bovine Lactoferrin

LI Ya-pu1，LIU Ling-jun2，SONG Xiao-qing2，WU Meng1，CHENG Hua1，LI Chun-sheng1
（1.Institute of Biology, Hebei Academy of Sciences, Shijiazhuang 050081, PRC; 2.Hebei Sanyuan Foods Co., Ltd., Shijiazhuang 050073, PRC ）

Abstract：Six strains of monoclonal antibody (McAb) cells against bovine lactoferrin (BLF) were obtained with BLF antigen immune BALB/c mice by the hybridoma cells technique, and the six McAbs were detected on the antibody titer, specificities and relative affinity; the BLF antigen was used with injection to immunize the New Zealand white rabbit so as to get 55 mL of rabbit polyclonal antibody (PcAb) serum; and the ascites fluid McAb and PcAb sera were analyzed on a series of characteristics in this study.The results showed that the titer of five of the six McAbs was basically over 1∶106; the six McAbs with good antibody specificity were of almost no cross reactivities with other proteins in milk, such as casein, lactalbumin and β-lactoglobulin, by the indirect ELISA; and the antibody in IgG1 subclass was, of higher 2B12 antibody affinity than other antibodies.The PcAb serum could be of the titer of over 1∶107, and the PcAb was of a certain specificity, i.e.low reactivities with casein, lactalbumin and β-lactoglobulin.

Key words：bovine lactoferrin; monoclonal antibody; polyclonal antibody; characteristic

作者简介：李亚璞（1980-），女，河北石家庄市人，助理研究员，主要从事免疫检测技术研究。

基金项目：河北省科学院基金项目（15305）

收稿日期：2015-11-09

DOI:10.16498/j.cnki.hnnykx.2015.12.002

中图分类号：R392

文献标识码：A

文章编号：1006-060X（2015）12-0005-03