液相色谱－串联质谱法检测食用油脂中多环芳烃

石龙凯 刘玉兰

(河南工业大学粮油食品学院，郑州 450001)

多环芳烃(Polycyclic aromatic hydrocabons，PAHs)是一大类广泛存在的环境污染物［1］，并且普遍具有致畸、致癌和致突变作用［2］。由于油料种子的迁移作用以及不当的油脂加工条件致使多环芳烃可能会进入食用油脂中，对消费者的身体健康造成损害。欧盟No 835/2011规定［1］，食用油和脂肪(可可脂和椰子油除外)中苯并(a)芘的限量为不超过2 μg/kg，苯并(a)蒽、屈、苯并(b)荧蒽、苯并(a)芘等 4种多环芳烃(PAH4)的总限量为不超过10μg/kg。我国GB2716—2005《食用植物油卫生标准》仅规定苯并(a)芘限量为不超过10μg/kg，对其它多环芳烃并未做出限量规定。根据多环芳烃化合物的存在情况及致癌性，美国环境保护署将16种多环芳烃化合物列为“优先控制污染物”即EPA16，以求更加全面的反映和监测多环芳烃化合物在环境及食品中的污染水平。虽然多环芳烃在食用油脂中的含量极低，然而，鉴于食用油脂在人们每日膳食中的普遍性和必要性，油脂中多环芳烃的含量水平值得高度关注并作为监控指标。

目前，对油脂中多环芳烃的国标检测方法有GB/T 22509—2008《动植物油脂 苯并(a)芘的测定反相高效液相色谱法》、GB/T 24893—2010《动植物油脂多环芳烃的测定》(高效液相色谱法)、GB/T 23213—2008《植物油中多环芳烃的测定气相色谱－质谱法》等。常用的检测方法是HPLC－FLD法［3－5］和 GC －MS法［6－8］。在上述方法中，HPLC 法不能够对所有的目标物进行检测，因为它们中有些物质(如苊烯)的荧光吸收很弱，不能够用荧光检测器进行定量分析。GC－MS法对某些低分子量热稳定性较差的多环芳烃检测效果较差，且脂类物质易在气相系统的进样口、毛细管柱及离子源积聚，增加了基线噪音，影响仪器分析性能，同时，检测目标物较多时，单次分析时间过长(40～50 min)。刘玉兰等［9］已经建立了一种LC－MS/MS法检测食用油脂中苯并(a)芘的快速、灵敏度高的方法，但该方法的研究当时仅针对苯并(a)芘的检测，未涉及食用油脂中其他多环芳烃成分的检测。

本研究建立了一种有机溶剂萃取、硅胶固相萃取柱净化、内标法定量、液相色谱－串联质谱(LCMS/MS)测定食用油脂中EPA 16种多环芳烃的检测方法。与常规的HPLC－FLD法和GC－MS方法相比，本方法分析时间短，选择性以及灵敏度高，适合于食用油脂中多环芳烃的定量分析，检测结果能更加全面、准确地反映食用油脂中多环芳烃各组分的含量水平。

1 材料与方法

1.1 材料和试剂

7类(40份)市售食用油脂:自购。包括菜籽油4份、大豆油8份、橄榄油5份、花生油4份、葵花籽油4份、玉米油5份以及芝麻油10份。

EPA 16种多环芳烃混标(200μg/mL，98%，溶解于乙腈):O2si公司;16种氘代同位素内标(97%):Dr.Ehrenstorfer GmbH 公司;乙腈、甲苯及环己烷(色谱纯):Sigma公司;硅胶固相萃取小柱:Supelco公司;超纯水，Milli－Q超纯水机制取。

1.2 试验仪器

安捷伦1200型液相色谱仪，配有G1329A自动进样器、G131lA四元混合泵和G1316A柱温箱:美国安捷伦公司;API 5500三重四极杆串联质谱仪，配有光电离离子源(APPI)和Analyst 1.5.1软件数据处理系统:美国应用生物系统公司;日立L－2130泵:日本日立高新技术公司。

1.3 分析方法

1.3.1 标准溶液的配制及标准曲线的绘制

EPA 16种多环芳烃混标用乙腈稀释20倍作为标准储备液，各目标物浓度为10μg/mL，工作液由储备液梯度稀释获得，目标物最终浓度为100 ng/mL。16种氘代内标混合标准溶液溶解于乙腈，各内标物浓度为1μg/mL。所有的标准溶液储备于棕色瓶中，置于4℃保存。目标物标准曲线的浓度范围为0.5 ng/mL～1μg/mL之间。按照优化的液相和质谱条件分析，以标准溶液中目标物浓度/内标物的浓度为横坐标，标准溶液中目标物峰面积/内标物的峰面积为纵坐标绘制标准曲线。

1.3.2 样品前处理

称取1±0.01 g油脂样品于15 mL塑料离心管中，加入60μL内标混合液及8 mL乙腈，以2 000 r/min震荡9 min，接着以6 000 r/min离心3 min，上层有机相转移至玻璃试管中，整个萃取过程再重复1次，合并2次的萃取液。萃取液蒸干后溶解于2 mL环乙烷，上样于事先用环己烷平衡好的硅胶固相萃取小柱。以8 mL环己烷淋洗小柱，收集上样液与洗脱液，氮吹至干，复溶于200μL乙腈，取5μL上样分析。

1.3.3 回收率和精密度试验

取均一的油脂样品，分为3组，构成高中低3个加标组及1个空白对照组。加标水平分别为0.05、2、10μg/kg，每个水平重复测定6次，计算回收率。以上选取的高中低3个加标水平的油脂样品，在同一天内重复测定其含量5次，计算日内精密度;在连续6 d内每天测定其含量3次，计算日间精密度。均以RSD表示。

1.4 色谱－质谱条件

色谱条件:液相色谱柱，Agilent Zorbax Eclipse PAH柱(2.1 mm × 100 mm，3.5μm);柱温箱，25℃;流动相A，乙腈;流动相 B，水;流速，0.4 mL/min;进样量，5μL;掺杂剂，甲苯;流速，100 μL/min;梯度洗脱，流动相 A的比例:0～5 min，45%;5～15 min，45%～100%;15～21 min，100%;21～22 min，100%～45%。

质谱条件:离子源电压800 V;离子源温度650℃;气帘气10 psi;碰撞气7 psi;雾化气80 psi;辅助加热气60 psi;驻留时间50 ms;离子模式，正离子模式。16种多环芳烃及其内标物离子对及碰撞能见表1。

表1 EPA 16种多环芳烃及氘代内标物的离子对及碰撞能

1.5 健康风险评价［1］

采用苯并(a)芘的毒性当量(toxic equivalent quantity，TEQ)，计算EPA 16种多环芳烃的毒性当量TEQB(a)P。规定以苯并(a)芘为标准参考物，其毒性当量因子(TEF)值为1，将其它多环芳与等量的苯并(a)芘对比毒性大小，得出各个多环芳烃的TEF值，TEQB(a)P的计算公式如下:

式中:Ci为第i个多环芳烃的质量浓度，ng/kg;TEQB(a)P为基于苯并(a)芘的毒性当量，ng/kg;TEFi为第i个多环芳烃对应的TEF值。

2 结果和讨论

2.1 方法的线性关系及检出限

在选定的色谱和质谱分析条件下对1.3.1中的系列混合标准溶液进行分析。线性方程和相关系数由analysit 1.5.1软件给出，所有目标物都能保持好的线性关系，线性相关系数达到0.999 2～0.999 9。检出限由3倍信噪比得来，定量限为10倍信噪比。EPA 16种多环芳烃检出限和定量限分别为0.006～0.129μg/kg和0.02～0.43μg/kg。表2给出了EPA 16种多环芳烃的线性关系及检出限和定量限。

2.2 回收率及精密度

在试验方法条件下，EPA 16种多环芳烃的回收率在86.5%～104.6%，日内精密度小于6%，日间精密度小于5%，表明方法对食用油分析具有良好的精密度和重复性，具体分析测定结果见表3。

表2 EPA 16种多环芳烃的线性关系及检出限和定量限

2.3 实际样品的测定

利用建立的LC－MS/MS检测方法，对所采集的7类(40份)食用油脂中的EPA 16种多环芳烃的含量进行了测定。油脂样品中目标物色谱图见图1。可以看出，使用建立的前处理方法及分析，油脂样品中的三酰甘油以及其他干扰物质都被很好地去除，色谱柱以及选择离子的使用能够使同分异构体以及其他共存物很好的基线分离。同时，氘代内标的使用，使定量结果更加可靠。

由表4可知，40份油脂样品中EPA 16种多环芳烃的均值为 52.39μg/kg，含量范围为 11.68～146.06μg/kg。其中轻质多环芳烃是食用油脂中主要的多环芳烃污染物，占总量的80%以上，均值为43.88μg/kg，范围为9.67～119.35μg/kg。所有目标物中菲的污染程度最高，平均样本含量为9.95 μg/kg，其次是荧蒽和芘，平均样本含量分别为5.83 μg/kg和5.01μg/kg。二苯并(a，h)蒽的污染程度最低，平均含量为0.35μg/kg。受测油样中，虽然轻质多环芳烃的总量是重质多环芳烃总量的5.3倍，但是重质多环芳烃的TEQB(a)P值却是轻质多环芳烃的13.1倍。主要原因在于重质多环芳烃的潜在致癌性高于轻质多环芳烃，其TEF值是轻质多环芳烃的100～1 000倍。同时也说明食用油脂中重质多环芳烃的致癌风险更强，对食用消费者的危害性更大。

表3 方法的回收率和精密度/%

图1 油脂样品中EPA 16种多环芳烃色谱图

苯并(a)芘作为食用油脂的重要卫生指标，在40份油脂样品中的平均含量为1.35μg/kg，含量范围为0.12～4.72μg/kg，低于 GB 2716—2005规定的10μg/kg限量值。但是在40份油脂样品中，有8份样品苯并(a)芘含量高于2μg/kg，按欧盟标准不合格率为20%。有10份样品的PAH4含量高于10 μg/kg，按欧盟标准不合格率为25%。

表4 40份食用油脂中多环芳烃的存在情况

由于不同油料的油脂生产工艺不同，成品食用油脂中多环芳烃的分布情况也有所不同。由表5可知，7类食用油脂中，花生油和芝麻油是多环芳烃污染较为严重的2类油脂，而大豆油和葵花籽油中多环芳烃的污染程度最低。总多环芳烃污染水平为:花生油＞芝麻油＞橄榄油＞菜籽油＞玉米油＞葵花籽油＞大豆油。究其原因，可能是在花生油和芝麻油的生产过程中，为使产品有浓香风味，油籽往往要经过高温焙炒，过度的焙炒会使毛油中多环芳烃的含量增加。同时，为了保留在高温焙炒过程中产生的香味，浓香型花生油和芝麻油的精炼通常只采用沉降和冷滤，而不经过水化脱胶、碱炼脱酸、吸附脱色和水蒸气蒸馏脱臭等精炼过程，这就可能使多环芳烃因不能被高效脱除而残存在成品油脂中。菜籽油、大豆油、玉米油、葵花籽油的精炼一般都要经过完整的精炼过程，因此，这些油的多环芳烃含量是比较低的。其结果见表5。

碱炼脱酸、吸附脱色和水蒸气蒸馏脱臭被公认为是脱除多环芳烃的有效手段［10－11］。刘玉兰等［9］的研究发现，油脂碱炼过程对于苯并(a)芘的脱除有一定作用。张小涛等［12－13］研究发现，油脂的吸附脱色过程也能脱除苯并(a)芘，活性炭尤其是Norit活性炭对苯并(a)芘的脱除效果显著好于活性白土及其他吸附剂。水蒸气蒸馏脱臭能有效脱除油脂中的轻质多环芳烃［14］。因此，为了降低食用油脂中多环芳烃的含量水平，合理的制油工艺和完善的精炼工序都是必不可少的。

3 结论

本研究建立了一种有机溶剂萃取、硅胶固相萃取柱净化、液相色谱－串联质谱法(LC－MS/MS法)测定食用油脂中EPA 16种多环芳烃的检测方法。该方法前处理简单，分析时间短，灵敏度高。EPA 16种多环芳烃的定量限为0.02～0.43μg/kg，平均回收率范围为86.5%～104.6%。对40份油样的检测结果显示，EPA 16种多环芳烃的均值为52.39μg/kg，含量范围为11.68～146.06μg/kg。苯并(a)芘的平均含量为1.35μg/kg，范围为0.12～4.72μg/kg。对照我国GB 2716—2005规定，所有受测样品中苯并(a)芘含量均不超过≤10μg/kg的限量标准。但8个油样的苯并(a)芘含量超过了欧盟≤2μg/kg的限量标准，10个油样的PAH4含量水平超过欧盟≤10μg/kg限量标准。轻质多环芳烃的含量(范围为9.67～119.35μg/kg)远高于重质多环芳烃(范围为1.27～26.71μg/kg)，但重质多环芳烃的潜在致癌风险更大。多环芳烃各组分中，菲、荧蒽、芘三者的污染最为严重，二苯并(a，h)蒽的污染水平最低。7类受测油脂样品中，EPA 16种多环芳烃平均含量依次为花生油＞芝麻油＞橄榄油＞菜籽油＞玉米油＞葵花籽油＞大豆油，其差别可能主要与油脂制取和油脂精炼工艺及条件有关。从总体来看，虽然食用油中苯并芘含量超标率较低，但多环芳烃总量及风险更应受到重视，建议我国有关机构应加强对食用油中多环芳烃的检测和监管力度，规定多环芳烃的限量指标，确保食用油脂的品质安全。

表5 不同种类食用油脂中多环芳烃的存在情况

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