急性酒精性肝损伤小鼠模型及早期诊断指标G S TA 1 的研究

刘芳萍，马 欣，赵常伟，常轶聪，蔺月霞，李敏敏，刘颖姝，周 琼，李 植，李 睿，赵玉林，王德宁，刘景利，夏颖慧，迟 超

（1.东北农业大学动物医学学院，黑龙江 哈尔滨150030 ；2.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，黑龙江 哈尔滨150001）

研究表明，急性酒精性肝损伤的发病机制与其代谢产物引起的肝脏氧化应激[1]及肝细胞凋亡[2]密切相关。由于临床尚无特效药物治疗，其损伤又呈不可逆性，因此研究预防和早期遏制酒精性肝损伤的有效方法显得尤为重要。2013年美国FDA 指出传统的肝损伤黄金指标如ALT存在半衰期长，检测线高等缺点[3]。GSTA1 是谷胱甘肽S 转移酶（GST）家族中最重要的成员之一[4]，在肝细胞损伤时被快速大量释放入血，在亲电子物质解毒和清除脂质过氧化产物中起到重要的细胞保护作用。在急性肝细胞损害的各种疾病，如急性病毒性、中毒性和药物引起的肝炎和缺氧引起的肝损害[5]，可检测到GSTA1 含量升高。因此研究GSTA1 在肝损伤中的变化对肝病早期诊断具有重要意义，并为有效药物的筛选提供理论基础和试验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 昆明系小鼠，体重20±2 g，雄性，清洁级，购自哈药集团制药总厂实验动物中心。

1.2 乙醇致小鼠急性肝损伤模型复制 将20 只小鼠随机分成模型组和对照组，每组10 只。试验前小鼠隔夜禁食16 h，模型组按照14 mL/kg 体重剂量灌胃50%乙醇溶液，对照组不做任何处理。8 h 后各组眼球采血，制备血清，取新鲜肝脏制备肝组织匀浆，置于-80 ℃保存。

1.3 时间-效应试验 80 只小鼠随机分成10 组，每组8 只，包括9 个试验组和对照组。试验前小鼠隔夜禁食16 h。试验组按照14 mL/kg 体重剂量灌胃50%乙醇溶液，对照组给予等体积生理盐水，于1、2、4、6、8、10、12、16、20 h，眼球采血，制备血清。观察肝脏颜色、大小、光滑度和韧性。用酶联免疫分析法检测血清中GSTA1 含量，用赖氏法检测血清中ALT 活性。

1.4 剂量-效应试验 48 只小鼠随机分成6 组，每组8 只，包括5 个试验组（10、12、14、16、18 mL/kg）和对照组（给予等体积生理盐水）。试验前小鼠隔夜禁食16 h，灌胃8 h 后眼球采血，制备血清。观察肝脏颜色、大小、光滑度和韧性。检测血清中GSTA1 含量和ALT 活性。

1.5 数据分析 用SPSS 17.0 软件进行单因素方差分析（Dunnett′s 法统计分析）。

2 结果

2.1 乙醇致小鼠急性肝损伤模型建立 给予乙醇溶液后，8 h 未出现死亡鼠。模型组小鼠在酒精作用8 h 出现精神沉郁、喜卧、嗜睡，剖检见肝脏颜色黯淡、易碎、被膜紧张。模型组血清ALT 活性显著升高，与对照组相比差异极显著（P＜0.01），肝组织中SOD、GSH、GSH-Px 明显升高、MDA 大幅降低，与对照组相比差异极显著（P＜0.01），具体见表1。

表1 血清A LT 及肝组织S O D、M D A 、G S H、G S H-Px变化（X±s，n=10）

2.2 时间-效应试验 给予乙醇溶液后，20 h 内小鼠未出现死亡。各试验组小鼠均出现不同程度中毒现象。剖检可见肝脏肿胀、边缘变为红褐色，韧性减小易碎。各时间点血清GSTA1 和ALT变化见图1。乙醇处理2 h，GSTA1 含量变化与对照组相比差异极显著（P＜0.01），说明此时肝脏已有损伤，而ALT 活性在6 h 时才与对照组有显著差异（P＜0.05）。

图1 乙醇处理不同时间点小鼠血清中G S TA 1、A LT 变化 （X±s，n=8）

2.3 剂量-效应试验 给予乙醇溶液8 h 后，各剂量组小鼠未出现死亡，但均有不同程度的中毒现象。剖检可见肝脏色泽不均，质脆易碎，部分小鼠胆增大，高剂量组肝脏有出血斑。各试验组血清GSTA1 和ALT 变化见图2。当乙醇剂量为10 mL/kg 时，GSTA1 含量变化与对照组相比差异极显著（P＜0.01）；当乙醇剂量为12 mLkg 时，ALT 的活性变化与对照组相比差异显著（P＜0.05）；当乙醇剂量为14 mL/kg 时，ALT 活性显著升高，与对照组相比差异极显著（P＜0.01）。

3 讨论

近年来，随着酒精消费群体的增多，酒精中毒尤其是急性酒精中毒的人数与日俱增，带来严重的社会问题。理想的动物模型是研究的前提，酒精灌胃法造模周期短、易复制、稳定性好，无死亡，且符合人类大量饮酒所致急性肝损伤的特点，对研究酒精性肝损伤发病机制和筛选药物起关键作用[6]。本试验中，模型组MDA 含量显著升高，SOD、GSH 和GSH-Px 含量显著下降，说明机体氧化剂与抗氧化系统平衡被打破，乙醇对机体造成氧化损伤；ALT 作为传统的肝损伤黄金指标，血清中活性明显升高，表明肝脏已严重损伤。

血清ALT 主要分布在胞浆中，作为肝损伤标志物，升高幅度虽能反映出肝细胞坏死程度[7]，但需要建立在一定量的基础上，并且检出时间较长（＞43 h），检测线比较高。GSTA1 分子量小，容易进行检测，半衰期短（＜1 h），更增加了检测的准确性。本试验中，在肝损伤初期，模型组GSTA1 的含量先于ALT 活性4 h 开始升高，并且呈现时间依赖性，没有出现异常变化趋势，这与其在肝脏中的均匀分布关系密切；在肝损伤的恢复期，与ALT 活性比较，GSTA1 含量下降更迅速。GSTA1含量在乙醇剂量较低（10 mL/kg 体重）时便升高极显著，且增加量与剂量呈依赖性关系，ALT 则须达到一定染毒剂量（≥12 mL/kg 体重）才可以检测出明显变化。GSTA1 在肝脏中含量丰富，主要存在于肝小叶中心细胞，有更好的特异性，因此对肝代谢区的损伤更加敏感[8]。血清转氨酶在检测过程中容易受温度和溶血的影响，而GSTA1 在红细胞中不表达，且理化性质较稳定，避免了溶血和温度对试验结果的影响，使检测结果更准确。本研究GSTA1 含量检测采用酶联免疫吸附法，避免了ALT 在检出量和检出时间上的局限性，结果通过动态曲线表示，避免了取样不当引起的误差。

本研究以50%乙醇14 mL/kg 体重剂量灌胃，8 h 可成功复制急性酒精性肝损伤小鼠模型。从时间-效应上看，GSTA1 比ALT 更灵敏，对于及早发现肝病并进行防治意义重大；从剂量-效应上看，GSTA1 比ALT 检出限更低，在肝损伤较轻时便能检测出来，能更早、更快反应出肝脏变化，便于早期治疗。因此，GSTA1 作为急性酒精性肝损伤早期诊断的特异性指标，比ALT 更敏感，对肝损伤的进一步研究具有重要的临床意义。

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