铁皮石斛原球茎诱导分化与增殖试验

石丽敏，卢华兵，胡贤女

(浙江省东阳玉米研究所，浙江东阳 322100)

铁皮石斛 (Dendrobium officinale)，又名黑节草，为兰科石斛属植物，是传统名贵中药材，具有益胃生津、滋阴清热、止咳润肺的功效。现代药理研究表明，石斛还具有抗肿瘤、抗衰老、增强人体免疫力和扩张血管的作用。铁皮石斛蒴果成熟时易开裂，且种子粒径小，自然繁殖率低。由于铁皮石斛生长条件的特殊性和分布的局限性以及多年的人为过度采挖破坏，自然资源濒临枯竭，成为濒危植物，被列为国家重点保护的野生药材品种。因此，为了保护和有效利用铁皮石斛，采用组织培养技术，大量快速繁殖铁皮石斛组培苗显得尤为重要。以铁皮石斛种子诱导原球茎，再通过原球茎的分化、增殖培养而得到大量幼苗，这种快繁方法可加快铁皮石斛繁殖速度，推进工厂化育苗。笔者以铁皮石斛种子为外植体进行了铁皮石斛原球茎诱导与增殖的研究。

1 材料与方法

1.1 材料

供试铁皮石斛的成熟蒴果 (种龄5个月以上)采于浙江省东阳玉米研究所塘西试验基地。

1.2 方法

采集铁皮石斛成熟蒴果，经过表面消毒处理，剖开蒴果取出种子接种到原球茎诱导培养基上，经过一段时间的诱导，种子膨大产生原球茎并分化成小苗，将分化形成的小苗转移到增殖培养基中培养。基本培养基:MS+7.0 g·L-1琼脂+30 g·L-1蔗糖+0.5%活性炭，pH值5.8。培养条件:温度 (25±1)℃，光强为2 000 lx，光照时间12 h·d-1。

1.2.1 外植体的消毒处理

将铁皮石斛的蒴果先用自来水冲洗干净，再置于洗洁精溶液中摇洗10 min，取出蒴果用自来水洗净，沥干水后，在超净工作台上先用75%的酒精消毒2 min;倒去酒精，再用0.1%的升汞消毒15 min;倒去升汞消毒液，用无菌水冲洗4～5次，沥干备用。接种时，将经过表面消毒的蒴果放在无菌的不锈钢盘上，切除头尾约0.5 cm，然后将蒴果中段沿纵轴切开，取出种子，均匀地接种到培养基表面。

1.2.2 培养条件

培养室温度为 (25±2)℃，以日光灯为光源，光照强度为2 000～2 500 lx，每天照光12 h。

1.2.3 原球茎的诱导与分化

以MS和1/2 MS为基本培养基，设置8个处理，分别添加不同浓度的NAA，试验设计见表1。将种子接种在原球茎诱导培养基中，每处理接种5皿，接种后的培养皿先遮光培养10 d后，再进行光培养。40 d后统计原球茎的诱导情况，90 d后调查幼苗分化情况。

1.2.4 幼苗增殖

以MS为基本培养基，设置6个处理，分别添加不同浓度的NAA。将原球茎分化出的幼苗转接到幼苗增殖培养基中，每个处理接种10瓶，每瓶接种25株。90 d后调查统计幼苗增殖情况。

2 结果与分析

2.1 原球茎诱导与分化

接种10 d左右，种子开始萌发变绿，40 d左右可明显看到膨大的原球茎，且部分原球茎开始分化出芽尖。90 d左右可明显看到分化出的小苗。

试验中发现，不同处理上种子均可萌发诱导出原球茎，可知在培养基中不添加或者添加低浓度的NAA可促进种子的萌发。

由表1可以看出，以MS为基本培养基的处理原球茎诱导率均高于以1/2MS为基本培养基的处理。在激素配比试验中可看出，处理1，2的原球茎诱导率最高为100%，处理8的诱导率最低为20%。

表1 不同激素配比对原球茎诱导及分化的影响

处理2的幼苗分化率最高为99%，处理1，6次之，为90%。处理4，8的幼苗分化率最低，为5%。由此可以看出，高浓度NAA抑制幼苗分化，低浓度NAA促进幼苗分化。

综合原球茎诱导和分化情况可知，MS中添加0.1 mg·L-1NAA可有效促进铁皮石斛种子萌发和发育。

2.2 幼苗增殖

由表2可以看出，不同处理培养基上幼苗均能增殖，增殖系数随着NAA浓度增加而变大，处理4当NAA浓度为0.22 mg·L-1时，增殖系数最大，为3.8;随着NAA浓度进一步增加，增殖系数逐渐变小。处理3幼苗生长较整齐，苗较高，根系比较旺盛;处理4幼苗短小而粗壮，苗势较好。综合幼苗增殖和生长情况可知，MS中添加0.15～0.20 mg·L-1NAA可有效促进铁皮石斛幼苗增殖和生长。

表2 不同NAA浓度对幼苗增殖的影响

3 小结与讨论

通过接种成熟种子对原球茎诱导培养基筛选发现，在MS+0.1 mg·L-1NAA+7.0 g·L-1琼脂+30 g·L-1蔗糖+0.5%活性炭上，铁皮石斛成熟种子能顺利萌发诱导产生原球茎，并自然分化形成幼苗。在MS+0.15～0.2 mg·L-1NAA+7.0 g·L-1琼脂+30 g·L-1蔗糖+0.5%活性炭上，幼苗能快速进行增殖，并长出少量不定根。

组织培养获得铁皮石斛再生植株的途径有多种，关于利用成熟种子进行快繁，文献报道较多的是用成熟的种子消毒后进行无菌播种形成原球茎，并经过增殖、分化发育成完整植株［1］。本研究中种子消毒后无菌播种诱导产生原球茎，并直接分化出幼苗，再通过转换培养基促进小苗增殖，再进行生根壮苗进而达到快繁的目的。其他报道中的原球茎诱导、增殖再分化的过程需要3种不同的培养基，而本研究中，原球茎诱导、分化再增殖都在同一种培养基上，仅需再转接进行增殖，从而减少转接过程，在工厂化育种中大大减少了工作量，降低了成本。

［1］ 杨柳平，刘畅庆，赵仁发，等.铁皮石斛种子诱导原球茎组培快繁体系的研究［J］.广东农业科学，2012(7):54-57.