亚洲百合与东方百合远缘杂交亲和性1)

高雪 曹钦政 黄凤杰 贾桂霞

(北京林业大学，北京，100083) (中国科学院植物研究所) (花卉种质创新与分子育种北京市重点实验室(北京林业大学))

亚洲百合与东方百合远缘杂交亲和性1)

高雪 曹钦政 黄凤杰 贾桂霞

(北京林业大学，北京，100083) (中国科学院植物研究所) (花卉种质创新与分子育种北京市重点实验室(北京林业大学))

为得到花色丰富、带有芳香气味、抗性强的OA或AO(O为东方百合杂种系，A为亚洲百合杂种系)型优势杂种，采用常规杂交和切割柱头的方法进行杂交，结果AO型的22个组合，仅有亚洲百合‘Pollyanna’×东方百合‘Sambuca’这一组合得到了4个膨大的蒴果和40粒有胚种子，结实率为0.27%；85个LA(LA为Longiflorum hybrids×Asiatic hybrids的杂交后代)×O型组合均未得到完全膨大的果实和有胚种子；而21个OA型组合，有7个组合得到了膨大的蒴果及有胚种子。采用切割柱头的方法也未提高结实率，说明其没能有效克服其远缘杂交的障碍。通过花粉管荧光显微观察发现，亚洲百合和东方百合花粉几乎均能在母本的柱头上萌发，并沿着花柱道伸长生长，最终达到子房进入胚珠，说明AO型或OA型远缘杂交的受精障碍主要为受精后障碍。

亚洲百合；东方百合；远缘杂交亲和性；花粉管

百合(Lilium)是百合科(Liliaceae)百合属植物的总称，其花大色艳，姿态优美，清雅脱俗，既能做切花、盆花，又能用于园林绿化；既能观赏，又能食用和药用，深受人们的喜爱和欢迎。百合分布较广，主要分布在中国、日本、加拿大、美国和欧洲的温带地区。中国是百合属植物的自然分布中心，也是世界百合的起源中心[1]340。

20世纪以来，随着人工育成的百合栽培品种日益增多，英国皇家园艺学会(RHS)和北美百合学会(NALS)按照百合栽培品种和其原始亲缘种与杂种的遗传衍生关系分为9大类：亚洲百合杂种系(Asiatic hybrids)；欧洲百合杂种系(Martagon hybrids)；纯白百合杂种系(Candidum hybrids)；美洲百合杂种系(American hybrids)；麝香百合杂种系(Longiflorum hybrids)；喇叭形杂种系和奥列莲杂种系(Trumpet hybrids and Aurelian hybrids)；东方百合杂种系(Oriental hybrids)；其他杂种系(Miscellaneus hybrids)；百合原种系(Lily Species)[2]。其中亚洲百合花色丰富多样、花朵秀丽、植株挺拔，具有很高的观赏价值，但无香味；从抗病性而言，多数品种抗镰刀菌引起的枯萎病，但易感灰霉病[1，3]。东方百合花朵硕大，花型美丽，具浓郁的芳香气味，但花色较为单一；从抗性上而言，对鳞茎腐烂病敏感，但具有较强的灰霉病抗性[3-4]。若能综合亚洲百合和东方百合优良性状，得出花大色艳且有香味、抗病性强的杂种，将会有良好的市场前景，van Tuyl[5]就认为OA杂种(Oriental×Asiatic)是最有前景的杂交组合。但二者不仅外观性状相差很大，而且亲缘关系较远，杂交很难取得成功。二者间进行杂交成功的报道见于Okazaki et al[6]、Asano et al.[7]的论文，Chi[8]通过胚培养获得OA杂交种。目前，荷兰育种专家已经培育出OA杂交百合新品种[9]，而AO型杂交报道较少。

本研究以亚洲百合6个品种、LA杂种系百合24个品种和东方百合20个品种为试验材料进行杂种系间的正、反杂交，研究不同组合的杂交亲和性，并采用常规授粉和切割柱头授粉方法以期提高杂交结实率；同时运用荧光显微技术对远缘杂交花粉萌发及花粉管生长情况进行观察，以期初步了解远缘杂交的障碍机制，为今后百合杂交育种工作提供理论和技术支持。

1 材料与方法

本试验所用的百合栽培品种均于荷兰进口，栽培在国家花卉工程技术研究中心(北京林业大学)小汤山百合资源圃。杂交亲本共包括亚洲百合杂种系(A)6个品种、LA杂种系百合(LA，为Longiflorum hybrids×Asiatic hybrids的杂交后代)23个品种以及东方百合杂种系(O)20个品种。其主要性状见表1。

表1 杂交父、母本品种及其性状

杂交：远缘杂交试验于2012年7—8月份在大田中进行，授粉时环境温度为28～32 ℃，空气相对湿度约为40%。在亲本花蕾完全显色，开花前1～2 d去雄套袋，开花当天授粉。杂交组合授以目标父本的花粉，花期不能相遇的组合授以预先低温干燥保存的花粉。花粉在授粉前均进行花粉活力测定，花粉萌发液为蔗糖100 g·L-1+H3BO325 mg·L-1+CaCl230 mg·L-1[10]。选用花粉萌发率在30%以上的花粉进行杂交授粉。对每个杂交组合均采用以下两种方法杂交：常规柱头授粉，在开花当天11：00前，将待选花粉涂抹到母本的柱头上，并用锡箔纸包裹。切割柱头授粉，选取开花前一天包裹好柱头的花朵作为母本，在花柱基部0.5 cm处割断并纵切0.3 cm，在切割处涂抹花粉萌发液再给予授粉[11-13]。每个杂交组合授粉15朵，杂交后挂牌，并于7 d后除去锡箔纸，做好记录。

杂交亲和性观察：在授粉后统计子房膨大的情况，此后不断观察记录。若果实不再增大，颜色开始变黄，即将萎缩时进行胚拯救。若果实可以成熟则及时收获。以结实率和有胚种子数作为判断杂交亲和性的标准。其中，结实率=(成熟果实数/授粉花朵数)×100%。

花粉管的荧光显微观察：分别取授粉后1、12、24、36、48、56、72 h后的柱头和子房放入卡诺固定液(V(乙醇)∶V(醋酸)=3∶1)进行固定，并在4 ℃备用。压片前，分别用70%和50%的乙醇冲洗柱头和子房，再用蒸馏水进行洗脱。接着用8 mol·L-1的NaOH溶液浸泡10～30 min软化。最后用0.1%水溶性苯胺蓝溶液染色，压片后用Leica显微镜进行观察。

2 结果与分析

2.1 远缘杂交亲和性的评价

2.1.1 以亚洲百合、LA杂种系百合为母本，东方百合为父本的杂交亲和性

分别采用常规授粉和切割柱头的方法进行杂交，其中以亚洲百合为母本，选配了22个组合进行杂交，结果仅有‘Pollyanna’בSambuca’组合得到了4个蒴果(图1)及40个有胚的种子，结实率达到27%；而其余组合均败育(图2)。以LA杂种系百合为母本，共选配了85个组合，结果所有配组均未得到完全膨大的果实，个别组合虽有膨大现象，但却未得到有胚种子。杂交的大部分组合在授粉后30 d开始出现黄化、萎蔫的情况，并逐渐皱缩，剥开果实并未发现有胚种子。虽采用切割柱头方法进行杂交，但是结实率仍为0，说明切割柱头并未有效提高杂交结实率。

图1 ‘Pollyanna’בSambuca’杂交所得果实的生长情况

图2 以亚洲百合为母本、东方百合为父本的杂交败育现象

2.1.2 以东方百合为母本、亚洲百合为父本的杂交亲和性

同样分别采用常规授粉和切割柱头的方法进行杂交，杂交结实率和有胚种子数见表2。从表2可以看出，以东方百合为母本的杂交亲和性要大于以亚洲百合为母本的杂交亲和性。共杂交了21个组合，其中7个组合得到了有胚种子，分别为‘Corvara’בRenoir’、‘Tiber’בRenoir’、‘Tiber’בVal di Sole’、‘Acapulco’בPollyanna’、‘Acapulco’בRenoir’、‘Constanta’בNew wave’、‘Constanta’בPollyanna’，仅有一个组合(‘Tiber’בVal di Sole’)通过切割柱头的授粉方式得到了杂交种，说明切割柱头的授粉方式在获得

OA杂种方面的作用也并不明显。虽然有得到膨大的果实，但是结实率均低于50%，7个组合得到的蒴果内有胚种子均很少，而且不同组合间存在明显的差别。其中‘Tiber’בRenoir’得到有胚种子的数量最多，而且‘Tiber’作为母本与两种亚洲百合品种杂交得到的果实数以及有胚种子数均较高，‘Acapulco’、‘Constanta’作为母本也分别与两种亚洲百合杂交得到了果实及有胚种子，说明在以东方百合为母本的杂交中，‘Tiber’、‘Acapulco’、‘Constanta’都有良好的表现，均适宜作为母本应用。亚洲百合中‘Renoir’作为父本与3种东方百合都获得了杂种胚，‘Pollyanna’作为父本与两种东方百合获得了有胚种子，说明‘Renoir’、‘Pollyanna’在实际的杂交应用中，适合作为父本使用。

2.2 不同杂交组合授粉后花粉萌发及花粉管生长情况

由杂交结果得到了以东方百合为母本、亚洲百合为父本杂交后膨大的果实和有胚种子，选取其中杂交的5个组合进行花粉管伸长生长的观察。结果发现，所选的5个组合花粉管生长情况类似，表现为在杂交授粉后1 h无花粉粒萌发，到12 h后聚集在柱头表面萌发，伸长并不明显，授粉后24 h后，花粉管穿过柱头顶部进入花柱；授粉36 h后达到花柱1/2位置，60 h后花粉管穿过花柱基部进入子房；72 h后进入胚珠。其中，仅有‘Corvara’בNew wave’这个组合授粉后12 h花粉开始在柱头大量萌发(图3A)，到24 h花粉管穿过花柱头往下伸长生长；授粉36 h后达到花柱1/2位置，此时胼胝质反应变得异常激烈，花粉管卷曲回折(图3B)；最终在授粉144 h后花粉管到达子房(图3C)。

A.12 h花粉大量萌发;B.36 h花粉管出现缠绕卷曲;C.144 h花粉管进入胚珠。

而没有得到膨大果实和有胚种子AO和LA×O杂交组合也出现类似的情况。选取杂交5个AO组合和5个LA×O的组合进行观察，结果显示，在授粉12 h后花粉基本没有萌发(图4A)，24 h后萌发数量增多，但仍旧停留在柱头顶端的位置，并未深入花柱内部；36 h后花粉管开始深入花柱内部，并且生长到了一定的长度，进入中央花柱道(图4B)，然后花粉管慢慢生长伸长最终在授粉72～168 h到达子房并进入胚珠(图4C)。仅有LA×O型杂交组合‘Orange Tycoon’בMentezuma’的花粉管生长情况不佳，只有几条花粉管向下生长，花粉管没有到达子房进入胚珠，而其他组合均能到达子房进入胚珠。

总之，无论是亚洲百合还是东方百合的花粉均能在母本的柱头上萌发，花粉管也能进入柱头，虽然有一个组合由于花粉管太短没能进入子房到胚珠，但是其余组合的花粉管可以穿过花柱最终到达子房进入胚珠，说明AO或OA型远缘杂交不亲和的原因主要为受精后障碍。

A.12 h花粉部分萌发;B.36 h花粉管沿花柱生长;C.花粉管进入胚珠。

3 讨论

远缘杂交是百合新品种选育和种质创新的主要途径之一，但是远缘杂交不亲和给育种工作带来了一定的困难[14]。百合三倍体通常雄性不育，但可以作为母本杂交[15]。Zhou et al.[16]观察到在百合3X×2X/4X的杂交种，当胚乳具有5个或5个以上相同基因组时，胚乳发育较好，杂交也容易成功。本试验尝试选择三倍体LA杂种系为母本与东方百合进行杂交，结果在85个LA×O组合中均未得到成熟的果实和杂交种子，说明AO型杂交确实具有一定的困难。

除了常规的杂交方法，育种家们曾尝试多种授粉方式以提高杂交结实率。目前，切割柱头的方法是克服百合受精前障碍的最佳方法[11，14，17]，但其受杂交组合亲本的影响较大，不同亲本组合促进效果差异较大，切割柱头授粉对以花柱较长的东方百合作母本的杂交组合结实率有促进作用，而对以花柱较短的亚洲百合作母本的杂交组合则没有明显促进作用，甚至产生抑制作用[12]。本研究中，切割柱头的方法也未能有效提高远缘杂交的结实率。

用花粉管荧光观察技术能够直接判断高等植物自交与异交过程中花粉管的生长情况，对研究花粉管生长特性及杂交不亲和表达部位具有重要意义。荧光显微观察法简单方便快速有效，因此，国内外学者普遍运用这种方法研究果树、花卉等农作物杂交过程中花粉管生长情况[18-20]。Asano[21]以麝香百合为母本杂交授粉,发现花粉管在麝香百合花柱里生长受到了抑制,并且花粉管先端畸形膨胀，初步分析了百合杂交不亲和的机理。本试验研究表明，东方百合和亚洲百合的花粉均能在母本的柱头上萌发，并伸长生长，大部分组合的花粉管均能穿过花柱达到子房并进入胚珠，说明AO型或OA型远缘杂交障碍主要为受精后障碍，如受精后幼胚不发育或发育不正常，以及杂交种子的幼胚、胚乳和子房组织之间缺乏协调性，胚乳不能为杂种胚提供正常生长所需的营养，影响了杂种胚的发育[1]159-160。田忠平等[22]用母本柱头喷施KCL后授粉并对获得的种子进行胚拯救，使亚洲百合与东方百合3个杂交组成功获得杂种苗，对获得AO型有一定积极意义。今后可以尝试多种授粉方式结合的方法来提高远缘杂交的结实率[23-24]，并对获得的种子进行幼胚拯救以克服远缘杂交受精后障碍[5，25]。

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Compatibility for Lily Distant Hybridization between Asiatic Hybrids and Oriental Hybrids

Gao Xue, Cao Qinzheng(Beijing Forestry University, Beijing 100083, P. R. China); Huang Fengjie(Institute of Botany, Chinese Academy of Science); Jia Guixia(Beijing Key Laboratory of Ornamental Plants Germplasm Innovation & Molecular Breeding, Beijing Forestry University)/Journal of Northeast Forestry University，2015,43(3)：1-5.

An experiment was conducted to take hybridization to get advantaged AO or OA hybrids (A: Asiatic hybrids; O: Oriental hybrids) by normal pollination technique and cut-style pollination technique. In the experiment, with Asiatic hybrids as female parent, only one combination ‘Pollyanna’בSambuca’ among 22 combinations obtained fruits and embryos. While the number of swelling capsule and the rate of embryos reached 4 and 0.27%, respectively. With LA(LA: Longiflorum hybrids×Asiatic hybrids) hybrids as female parent, there was no fruit. However, with Oriental hybrids as female parent, 7 combinations obtained fruits and embryos. The method of cut-style pollination technique could not improve the seed rate, and failed to effectively overcome obstacles distant hybridization. The pollen germination and pollen tube growth were observed after pollination by fluorescence. The pollens of both Asiatic hybrids and Oriental hybrids could germinate on the stigma, and finally get into the ovule. Therefore, there was the hybridization barriers mainly after fertilization.

Asiatic hybrids; Oriental hybrids; Compatibility of distant hybridization; Pollen tube

高雪，女，1990年12月生，北京林业大学园林学院，硕士研究生。E-mail:496465679@qq.com。

贾桂霞，花卉种质创新与分子育种北京市重点实验室(北京林业大学)、国家花卉工程技术研究中心(北京林业大学)、城乡生态环境北京实验室(北京林业大学)、北京林业大学园林学院，教授。E-mail:gxjia@bjfu.edu.en。

2014年8月22日。

Q321+.3；Q949.71+8.23

1)林业公益性行业科研专项(201204609)、北京市园林绿化局计划项目(YLHH201400103)。

责任编辑：任 俐。