胱抑素C临床检验及在肾脏疾病应用中的研究进展

刘海燕 李伟娜 肖波 王华新

胱抑素C临床检验及在肾脏疾病应用中的研究进展

刘海燕 李伟娜 肖波 王华新

胱抑素C;临床检验;慢性肾脏疾病;急性肾损伤;肾小球滤过率

胱抑素C(cystatin C，CysC)是一种非糖化蛋白，由122个氨基酸组成，相对分子量130 kd，产生于人体所有有核细胞，不受年龄、性别、饮食、肌肉量和运动的影响，生成量非常稳定，仅在使用大剂量糖皮质激素或甲状腺功能异常时影响CysC的产生。CysC可以自由通过肾小球滤过膜的机械屏障与电荷屏障，并几乎全部在近曲小管重吸收，不被肾小管分泌。临床检测CysC已实现自动化、标准化，检验结果具有可比性，因此被认为是目前反映肾小球滤过功能的最佳、最有效的标志物，对评价GFR的敏感性和特异性可达88% ～98%和96% ～99%［1］。近年来国内外对CysC在临床中应用研究较多，以下就此作一综述。

1 CysC在临床检验中研究进展

1.1 检验方法及参考品研究进展 检测CysC的方法可概括为均相法和非均相法。因非均相法具有耗时长、线性范围窄、难以自动化等缺点，而被均相法替代。目前，检测CysC的均相法主要包括颗粒增强透射免疫比浊法(particle-enhanced turbidimertry immunoassay，PETIA)、颗粒增强散射比浊法(particle-enhanced nepholemetry immunoassay，PENIA)。PETIA 法可实现自动化、高通量、检测周期短等优点而更被广泛应用，以Roch和丹麦DAKO公司为代表;以Siemens公司为代表PENIA法因其准确度高、线性范围宽、不精密度低等特点而常被作为比对方法进行性能评价。

自2010年CysC参考品ERM-DA471上市后，使得CysC检测结果在不同检测方法间的一致性得到提高。2013年，我国采用以构建好的Pet32a-CysC菌体进行大肠埃希菌表达方法，经细胞破碎、离心、纯化酶切Trx-CysC融合蛋白，制备出纯化的重组人 SysC抗原［2］。该国标物具有较好的免疫活性，均匀性和稳定性。2～8℃密闭保存可稳定6个月，常温和37℃密闭保存可稳定至30 d，开瓶后2～8℃可稳定30 d，在包括PETIA法和PENIA法等10个常规测试系统上检测结果具有互换性，因而完全可以在临床检验中应用。

1.2 检验方法学性能验证进展 Li等［3］应用CLSI评价文件 EP6-A、EP9-A2、EP15-A2、EP17-A对 Siemens BNII、Roch(Cobas c501)、Genzyme(Cobas c501)进行了LoB、LoD、LoQ、不精密度、回收率、线性范围性能验证，并对 Roch(Cobas c501)、Genzyme(Cobas c501)与Siemens BNII对比分析。见表1。

表1 Siemens、Roch及Genzyme检测方法性能比较

LoB、LoD、LoQ评价结果均低于各公司声明的检测低限，但远低于参考区间的下限，而不影响临床应用。不精密度中Genzyme显示结果变异较大，超出声明书中的1.3% ～2.4%;回收率试验中Roch在低值血清回收率过高。Genzyme、Roch与Siemens BNII一致性分析回归公式中显示，Genzyme产生正偏倚，产生的原因是缺乏统一参考物质。

Voskoboey等［4］对 Roch公司 Gentian AS透射比浊法和Simens散射比浊法检测CysC在应用ERMDA471参考品前后结果进行对比。结果显示，Simens散射比浊法在应用校准品前约20%结果高于校准后，并且检测结果明显高于Roch公司透射比浊法检测结果。也有报道，PENIA法与PETIA法检测CysC存在较为明显的偏差，PETIA法检测结果偏高(可达20%左右)，尤其在高值时更加明显［5］。

国秀芝等［6］参考CLSI系列评价文件对国内上海景源、北京利德曼、北京九强公司生产的PETIA方法cysC试剂盒进行性能验证，并与Siemens BNII对比试验。见表2。

上海景源、北京利德曼、北京九强三种国产试剂与Siemens BNII对比分析线性相关性好，但存在明显偏差(bias%)分别为27.6%、32.7%、24.5%。与SiemensBNII一致性分析 Kappa值分别为 0.615、1.000、0.824。胆红素(≤684 μmol/L)对三种试剂均无干扰;血红蛋白≥6.78 g/L对上海景源试剂检测低浓度CysC产生负干扰，血红蛋白≥9.70 g/L对北京利德曼试剂检测低浓度CysC产生正干扰;上海景源试剂抗乳糜血能力不强，当乳糜浓度达到1 860 FTU时，对低浓度CysC产生负干扰。类风湿因子、高免疫球蛋白无影响。

表2 国产3种试剂性能比较

2 基于CysC的GFR评估公式在CKD疾病中应用进展

2.1 基于CysC的GFR评估公式研究现状 美国第三次健康营养调查数据(NHANESIII)显示，美国20岁以上人群CKD患病率高达11%;由王海燕教授牵头组织的首次中国慢性肾脏病调查结果显示，我国18岁以上成年人群中CKD患病率为10.8%［7］。GFR是CKD病情判断、预后及治疗最重要的参考指标。从1976年Cockcroft-Gault评估公式、1999年MDRD公式及2006年改良MDRD公式，以及2009年CKD-EPICr公式，到2012年CKD-EPICysC和 CKD-EPICr-CysC公式，公式内容越来越趋于简单、实用，应用范围越来越广泛，对CKD预后估算结果越来越准确。但基于CysC的评估公式在研究进展过程中，呈现出了公式多样化、内容差异大等复杂局面。出现这种状况的原因:(1)CysC检测方法未标准化:CysC检测方法主要包括PETIA和PENIA两种方法，但两种方法间检测结果存在一定偏倚，如上所述，PENIA法检测结果明显高于PETIA法，尤其在高值时更明显;因而，在应用评估公式时，应保持检测方法一致性。Grubb 公式［8］、Larsson 公式［9］、Rule 公式［10］以及 Stevens LA 公式［11］等，eGFR 估算结果差异很大，很重要原因是在2012年前没有CysC参考品，各家公司参考本公司的标准，因而检测结果没有可比性。联合血清肌酐的eGFR公式，因肌酐检测方法由过去的Jaffe法发展到现在的酶法，也是造成差异大的原因之一。肌酐和CysC单位多采用mg/dl和mg/L，2007年中国eGFR课题组建立的公式中肌酐单位为μmol/L，在使用时应引起注意。(2)评估公式所参考方法不统一:目前，直接检测GFR的参考方法(rGFR)主要有:碘海醇清除率、碘酚酸盐清除率、99mTC-DTPA清除率、51Cr-EDTA清除率及菊粉清除率等。碘海醇清除率应用HPLC检测碘海醇，99mTC-DTPA和51Cr-EDTA应用核素显影技术，菊粉清除率应用化学分光光度计检测，不同的检测方法检测性能如灵敏度、特异性和精密度等差异很大，检测结果也没有可比性［12］，由此所推导的eGFR公式可比性差。(3)参考人群多样化:GFR评估公式的创建者参考的人群多样化。如Grubb公式参考人群包括成人和儿童肾病患者，Rule公式参考人群包括健康成人、CDC和肾移植患者，而CKD-EPICysC公式和CKD-EPICr-CysC公式参考了不同人群。大部分公式参考白种人、非洲裔美国人和西班牙语系人［11］。全球肾脏疾病预后改善组织(KDOQI)建议各国应建立适合于本国和不同人种的评估GFR公式。(4)变量参数不一致:公式中除检测项目(CysC和Cr)参数外，如Cockcroft-Gault GFR公式还包括年龄、体重，IDMS-MDRD公式、CKD-EPI公式、CKD-EPICysC和CKD-EPICr-CysC公式变量参数包括性别、年龄、种族。Grubb公式、Larsson公式、Rule公式以及Stevens LA公式等，公式内容简单，涉及参数仅包括CysC。

2.2 基于CysC的GFR评估公式性能验证进展

2.2.1 诊断准确性验证:最近，国内外多项验证研究表明CKD-EPICr-Cys评估公式较比CKD-EPICr和CKD-EPICysC评估GFR准确度和精密度更高(公式见表3)［13，14］。与rGFR 相比，CKD-EPICr、CKD-EPICysC和 CKD-EPICr-CysCP30分别为 87.2%、85.9%和 91.5%，偏差分别为3.7 ml·min-1·1.73 m-2、3.4 ml·min-1·1.73 m-2、3.9 ml·min-1·1.73 m-2。见表 3。

基于CysC评估公式与GFR存在线性关系，包括CKD G2 期 GFR 在 60 ～90 ml·min-1·1.73 m-2［15］。2012年KDOQI发布的临床指南中建议，应用基于肌酐的评估公式可行初步评估，再以 CKD-EPICys、CKD-EPICr-CysC和rGFR进行确证。当eGFRCr结果在45 ～59 ml·min-1·1.73 m-2时，应检测 CysC，若 eGFRCr-Cys＜60 ml·min-1·1.73 m-2时 CDK 诊断成立，若 eGFRCr-Cys＞ 60 ml·min-1·1.73 m-2时可排除CKD。

Zhu等［16］通过小样本(n=788)验证6个重要GFR评估公式在中国人群适用性，结果显示，在60岁以下人群CKD-EPICr-CysC准确性比较高，当GFR正常时与rGFR对比符合率75%、GFR中度异常时为56.1%，CKD-EPICr和 CKD-EPICys则分别为86.3%、38% 和64.7%、53.8%;在60岁以上人群中CKD-EPICr-CysC在GFR正常时与rGFR符合率仅为20%、GFR轻中度异常符合率为51.8%、中度以下异常时符合率达93%。同时，验证了中国eGFR协作组［17］建立的评估公式，评价结果显示该公式在中国人群中的应用仍有许多误差，准确性有待提高。但尚未见多中心、大样本对评估公式在中国人适用性验证的报告。

表3 CKD-EPICr-Cys和 CKD-EPICys公式

Inker等［12］验证结果认为，CDK-EPI三个评估公式在评估GFR的临床诊断价值基本相同，只有在肌酐检测不适宜情况下，才需要采用基于CysC评估公式。

2.2.2 评估预后:在预测全因死亡(all course mortality)、心血管疾病、终末期肾病(ESRD)、高血压、心力衰竭等方面，CKD-EPICr-Cys、CKD-EPICysC公式较比 CKDEPICr公式更准确。Shiipak等［18］荟萃分析了GFR评估公式在90 750例普通人群和2 960例CKD患者评估全因死亡、心血管死亡和ESRD风险的16篇文献，分析认为，CDK-EPIcysC和CKD-EPICr-CysC预测全因死亡、心血管死亡和ESRD比CDK-EPIcr预测风险率(HR)分别提高 0.21、0.13，0.16、0.11，0.03、0.07，CKDEPICr-CysC预测风险能力处于其他两种公式之间，基于CysC评估公式在预测ESRD与CDK-EPICr的能力基本相同;但有人采用三种公式评估16 279例ACS患者死亡和心肌梗死风险，ROC-AUC值没有差异(0.6743、0.6745、0.6731)，甚至提出CysC不是判断预后或风险评估的优势指标［19］。

2.2.3 肾病分期:KDOQI指南以GFR值为标准将CKD分为5期，G3期又分为3a和3b期，指南中以GFR 60 ml·min-1·1.73 m-2作为诊断CKD临界点。Shiipak等［18］荟萃分析中显示，3种EPI-CKD评估公式在肾病分期中存在明显的差异。CDK-EPICr估算GFR后用CKD-EPICysC重新分期，CDK-EPICr在CKD G1～G5期高估率达10% ～32%，而 CKD-EPICysC高估率达17%～47%，CKD-EPICr-CysC评估介于两者之间，但与CKD-EPICysC接近。因此建议，采用基于 CysC评估GFR时应以85 ml·min-1·1.73 m-2作为诊断 CKD临界点。国内学者评价结果显示，CKD-EPICysC公式在CDK G1、G3期GFR明显降低，导致低估肾脏滤过功能，CKD-EPICr-CysC在G5期GFR明显增高，导致高估;在CKD五个病程分期中，CKD-EPICr-CysC优于其他公式，与rGFR一致性最高，但表现不佳，Kappa值仅为0.348 ～ 0.463［14，20，21］。

2.2.4 儿童和老年人人群的适用性验证:Deng等［22］应用14个适宜于儿童的GFR评估公式对年龄平均在12.6岁(0.7～20岁)，包括少数特殊病例(如单肾、肾移植、身体矮小)进行适用性进行验证，在14个评估公式中仅有3个公式最能符合要求，这3个公式是Schwartz(2009)、Schwartz(2012)和 Chehade公式(见表 4)，参数包括年龄、性别、身高、血清肌酐浓度、血清Cys C浓度和血清尿素浓度。3个公式与rGFR相关性(r)分别为0.87、0.88、0.79，偏差分别为 -2.5 ml·min-1·1.73 m-2、-2.3 ml·min-1·1.73 m-2、0.7 ml·min-1·/1.73 m-2，P15分别为58.0%、61.7%、58.3%，P30分别为79.0%、82.7%、77.8%。在单肾、肾移植、身体矮小患者中也表现出较为满意的评估结果。见表4。

Van Pottelbergh 等［23，24］评价 MDRD、CKD-EPICr、CKD-EPICysC、CKD-EPICr-CysC和 BIS(柏林公式)eGFR 公式在老年人中的应用。Van Pottelbergh等［23］对539例80岁以上老年人进行了近3年的追踪随访，5种公式在预测心血管死亡、住院指数具有显著相关性，除了CKD-EPICysC公式外，其他公式与心血管事件相关性差，CKD-EPICysC和CKD-EPICr-CysC对预测死亡和心血管事件分别提升25%、18%和7%、9%的准确性。Lopes等［24］通过对95例年龄在85岁以上老年人进行横断面分析，CKD-EPICr和CKD-EPICr-CysC与rGFR偏差最小，CKD-EPICr-CysC与 BIS公式准确性 P30分别为 85%、83%;CKD-EPICysC、CKD-EPICr-CysC和 BIS公式 ROCAUC值分别为0.87、0.88和0.88。

表4 3个适用于儿童的eGFR公式

2.3 在急性肾损伤(AKI)中的应用 AKI是由多种病因导致GFR急速下降为特征的一种综合征。2%的住院患者可发生AKI，AKI更多见于ICU监护患者(36% ～60%)和败血症患者(50%)，一旦发生AKI病死率达50% ～80%。KDIOQ对AKI临床应用指南指出，CysC因其比肌酐所特有的在体内稳定的产生和代谢可作为AKI的早期诊断标记物。

2.3.1 在ICU中应用:Herrero-Morin等［25］检测25例GFR低于80 ml·min-1·1.73 m-2在ICU的儿童血清CysC和肌酐，CysC和肌酐对诊断AKI的AUC值分别为0.85、0.63;Herget-Rosenthal等［26］对 44 例进展为AKI患者血清CysC和肌酐检测，CysC浓度增高50%比肌酐浓度提早(1.5±0.6)d。Zhang等［27］对13项研究进行Meta分析，血清CysC对诊断AKI的AUC值0.86～0.96，尿液中 CysC的 AUC值为 0.64。但对CysC 诊断价值仍有很多争议，如 Royakkers 等［28，29］观察ICU患者进展为AKI前1 d和前2 d，血清和尿液中CysC诊断价值分别为0.62、0.46和0.72、0.49，并且认为血清肌酐对AKI的诊断价值比血清CysC毫不逊色，检测CysC在预测肾脏替代治疗、肾脏功能修复、死亡等方面价值不大。

2.3.2 在心脏疾病中应用:Shlipak等［30］报道1 147例心脏手术患者进展为AKI过程中，CysC在预测准确性明显高于肌酐和GFR;而Spalipak等［31］以术后肌酐或CysC升高35%为AKI阈值，观察的150名心脏手术后AKI患者中仅有23%CysC超过阈值，有35%肌酐超过阈值，认为CysC对诊断AKI的灵敏度不及肌酐。

KDIOQ AKI Work Group［32］以 24 h CysC 浓度增加20%为阈值，能检测出21.2%造影剂诱导AKI患者，其阴性预测值(NPV)为100%，阳性预测值(PPV)为39%。Ribichini等［33］比较肌酐和CysC在行冠脉造影和介入治疗后发生造影剂性肾病的诊断价值。166例患者测定基础、冠脉造影和介入治疗后12 h、24 h、48 h肌酐和CysC浓度，以肌酐和CysC变化量来评价诊断灵敏度和诊断特异度。结果显示，肌酐变化量可最早在12 h预测造影剂性肾病，AUC值0.8，诊断灵敏度为43%，特异度为93%;CysC诊断价值不如肌酐，CysC在12 h预测造影剂性肾病，AUC值0.49，诊断灵敏度为46.7%，特异度为48.5%。

CysC因其具有的生物学特性，在临床中的应用越来越广泛。在临床检验中，检测CysC方法学性能可满足临床需要。由于在创立评估GFR公式中应用所参照的参考方法、参考人群、CysC和肌酐的检测方法、疾病谱等不同，出现了公式多样化、评估结果不一致的现状。CKD-EPI公布的基于 CysC的两个公式(CKDEPICysC、CKD-EPICr-CysC)在评估成年人CKD的GFR准确性、评估CKD患者预后及CKD分期方面优于其他公式，尤其CKD-EPICr-CysC公式。而对儿童CKD的GFR评估采用Schwartz等公式比其他评估公式准确性更高。CysC在AKI中应用争议较大，许多研究表明，肌酐、CysC对AKI诊断价值基本相同。国内建立的基于CysC评估GFR公式的适用性有待于大规模、多中心验证。

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R 692

A

1002-7386(2015)21-3311-05

10．3969/j．issn．1002-7386．2015．21．040

071000 河北省保定市第五医院(刘海燕、李伟娜、肖波);河北省黄骅开发区博爱医院(王华新)

2015-05-09)