响应面设计优化双水相法测定食品中铁的量

陈婷婷，陈林林

(1. 黑龙江中医药大学 药学院数理教研室，哈尔滨 150040；2. 哈尔滨商业大学 食品工程学院，哈尔滨 150076)

响应面设计优化双水相法测定食品中铁的量

陈婷婷1，陈林林2

(1. 黑龙江中医药大学 药学院数理教研室，哈尔滨 150040；2. 哈尔滨商业大学 食品工程学院，哈尔滨 150076)

利用响应面设计对双水相法测定食品中铁的量工艺条件进行优化.以含铁量为指标，采用响应曲面分析法，对萃取温度、聚乙二醇体积分数和硫酸铵质量进行三因素三水平的优化试验，并建立了相应的回归模型.最佳提取工艺条件为，萃取温度为37.31 ℃，聚乙二醇体积分数为14.42%，硫酸铵的质量为7.92 g.在优化条件下，铁的量理论值为71.48 mg/kg，试验值为(71.48±3.6) mg/kg.试验值与理论预测值基本吻合，说明采用响应面法优化的工艺参数是准确可靠的，具有一定的实用价值.为证明实验的合理性，测定回收率，结果介于95%～106%之间，在回收率的误差范围之内，说明双水相法在铁含量测定中是一种较好的方法.

铁；双水相萃取；分光光度法；响应面设计

铁是人体内含量最大的微量元素，主要以铁卟啉络合物的形式存在，它对呼吸的作用最大. 作为血红蛋白的主要成分，由于高价铁和低价铁容易相互转变，它成为输氧能力最优的材料.铁元素在人体中促进生长，参与血蛋白及酶的合成，也具有造血功能；还起运输营养物质和氧的作用，功能性铁是铁存在于人体的主要形式，如果铁不足可导致皮肤失去了美的光泽、缺铁性贫血、骨骼发育异常、体重增长迟缓等影响.因此测定食品中铁的含量具有很大的意义.铁含量的测定，随着科技的进步，测定方法也越来越多[1]，如分光光度法[2-9]、火焰原子吸收法[10-11]、重络酸钾容量法、氟铁恒电位配位滴定法、极谱法等.相比于其他提取方法而言，双水相体系萃取技术在纯度以及时间方面展现了一般方法没有的优点，柴化鹏等[12]运用异丙醇/双水相萃取体系、荧光法测定了维生素B6，该方法具有简便、萃取率高、干扰小、低毒等显著特点.刘奇[13]运用乙醇/硫酸铵双水相测定了粮食中钼的含量，该双水相体系萃取速度快，操作简便，稳定性好，为金属离子的测定开发了新的方法;同样的，黄秀锦[14]等人运用此方法测得了食品中金属元素的情况.胡松青[15-16]等人也研究了双水相萃取的新应用以及发展进程.目前尚未见双水相法测定食品中铁含量的研究.本文以市售香菜、苹果、猪肉、黄豆、红豆为样品，经灰化后，采用双水相法对它们进行萃取，然后测定铁的含量，并对其工艺进行优化，以期为食品中铁含量测定方法提供理论依据和技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

红豆、黄豆、香菜、猪肉、苹果，均为市售.聚乙二醇，北京益利精细化学品有限公司；无水乙醇，天津市天力化学试剂有限公司；硫酸亚铁铵，哈尔滨市化工试剂有限公司；硫酸钾，天津市天新精细化工开发中心；乙酸钠，天津市福晨化学试剂厂；磷酸氢二钾，天津市耀华化学试剂有限公司；磷酸二氢钾，沈阳市试剂厂；邻菲啰啉，天津市天新精细化工开发中心；盐酸羟胺，吉林省军区化工厂；正丁醇，天津市永大化学试剂有限公司；硫酸铵，天津市天新精细化工开发中心.

UV2550紫外可见分光光度计，上海精密科学仪器有限公司；HH-4型数显恒温水浴锅，余姚市东方电子仪器厂；DHG-9203A型电热恒温鼓风干燥箱，上海精宏实验设备有限公司；ALC-210.2型电子分析天平，北京赛多利斯仪器系统有限公司；BLMT-QA马弗炉，天津市中环实验电炉有限公司；SJ260C型植物搅碎机，顺德兰谱电器制造有限公司；BW-PHS-3C型pH计，上海玛蒙工业设备有限公司.

1.2 实验方法

1.2.1标准曲线的绘制

用吸管分别吸取质量浓度为0.01 mg/50 mL的铁标准溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0 mL于9只50 mL的容量瓶中，再分别加入通过标准曲线影响条件测得的1.0 mL体积分数为1%的盐酸羟氨，5.0 mL pH值为4.6的缓冲溶液，体积分数为0.1%的2.0 mL邻菲啰啉，然后用蒸馏水稀释至刻度，摇匀，放置15 min，用1 cm的比色皿，在可见光分光光度计最大吸收波长下，分别测量吸光度(A)；以铁的量(mg/50 mL)为横坐标，以吸光度(A)为纵坐标，作标准曲线.

1.2.2双水相萃取法

用量筒量取体积分数为10%的聚乙二醇溶液于分液漏斗中，加入一定量的(NH4)2SO4，待形成均匀的盐溶液后，加入2.0 mL质量浓度为0.01 mg/50mL的样品溶液，1.0 mL体积分数为1%的盐酸羟氨，5.0 mL pH值为4.6的缓冲溶液以及2.0 mL体积分数为0.1%的邻菲啰啉，再用蒸馏水稀释至刻度后调节pH值到4，震荡摇匀，在一定温度的水浴锅中萃取2 min，冷却至室温后，再收集上层液体，用1 cm的比色皿，测量吸光度，得到曲线图.

1.2.3响应面设计优化双水相法测定食品中铁含量

为考察系统各因素水平对双水相萃取效果的影响情况，在单因素试验结果的基础上，选择影响萃取效果显著的三个因素：(A)萃取温度、(B) 聚乙二醇体积分数、(C)硫酸铵质量，根据Box-Behnken实验设计安排实验.实验指标值为铁的含量.用 Design Expert 7.0 统计软件设计三因素三水平响应面优化实验.见表1.

1.2.4含铁量的计算公式

其中：X表示样品中铁的量，mg/g；C表示测定用液中铁的质量浓度，mg/mL；(由标准曲线查出)；m样表示样品的质量，g；V定表示样品定容的体积，mL；V测表示测定用液的体积，mL.

表1 Box-Behnken 因素水平编码表

水平因素A萃取温度/℃B聚乙二醇体积分数/%C硫酸铵质量/g130107240158350209

1.2.5样品的回收实验

在测定含铁量的回收实验中，选取两个50 mL的容量瓶，标记为1、2号，分别在瓶中加入样品液3.0 mL，在2号比色管中加入0.05 mg/50 mL的标液，再加入1.0 mL体积分数为1%的盐酸羟胺溶液，5.0 mL pH值为4.6的缓冲溶液与2.0mL体积分数为0.1%的邻菲啰啉，并调pH值为4，定容、摇匀，静置15 min后，用3 cm比色皿在最大波长下测吸光度.回收率的计算方法

其中：P表示样品的回收率；X1表示样品中铁的量mg/g；X表示标铁的加入量mg/g；X2表示标铁和样品的总铁量mg/g.

2 结果与分析

2.1 标准曲线的建立

根据对影响标准曲线的优化条件进行分析的结果，分别选取各影响条件的最佳数值，即：溶液pH值为4.8盐酸羟氨1 mL 、缓冲溶液5 mL、邻菲啰啉2 mL、显色时间15 min 进行对溶液吸光度的测定，再根据铁元素的标准曲线绘制方法，在510 nm处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，以铁标准溶液的质量浓度为横坐标绘制标准曲线，得到了相应的回归方程：y=4.345 2x+0.080 5，R2=0.994 5，线性范围为0.080 5～0.432，见图1.

图1 Fe2+溶液的标准曲线

2.2 响应曲面试验结果及数据分析

2.2.1回归模型的建立与数据分析

根据单因素试验结果和Box-Behnken 实验设计原理，对萃取温度(A)、聚乙二醇体积分数(B)以及硫酸铵的质量(C)进行三因素三水平的响应面优化试验，应用Design-Expert7.0 软件进行分析，得出铁的量的最佳提取条件，实验设计与结果见表2.

表2 试验方案及结果

试验号A萃取温度/℃B聚乙二醇体积分数/%C硫酸铵质量/gY铁的量/(mg·kg-1)1-1-1068．2921-1065．353-11065．90411063．895-10-161．18610-159．617-10156．57810155．1290-1-158．471001-157．10110-1155．611201154．971300071．451400070．921500071．34

以含铁量作为响应值Y，以萃取温度(A)、聚乙二醇体积分数(B)以及硫酸铵的质量(C)为因素, 得到含铁量和编码自变量的二次回归模型方程为：

Y=7124-1.00A-0.73B-1.76C+0.23AB+0.030AC+0.18BC-1.90A2-3.48B2-11.22C2

对模型进行方差分析和显著性检验，结果见表3.由表3可知，模型的F=530.22，相应的概率值P<0.000 1，证明试验所选用的二次模型具有极显著性.失拟项F=3.00，相应的概率值为P=0.0734>0.05，失拟不显著，结果证明该回归方程无失拟因素存在，回归模型与实测值能较好地拟合.此外，该模型的决定系数为99.41%，说明该模型能解释99.41%响应值的变化，校正后为98.34%，说明方程拟合较好，并且变异系数较低，为1.27，表明试验的精确度较高，可靠性强.综上所述，回归方程给铁含量的测定提供了一个非常合适的模型，可以用于双水相法测定食品中铁含量的研究.

模型中一次项A萃取温度、B聚乙二醇体积分数、C硫酸铵质量的影响是显著的(P<0.05)；在二次项中，因素A、B 达到显著水平(P<0.05)，因素C达到极显著水平(P<0.000 1).在交互项中，各因素之间的交互影响不显著(P>0.05)，可忽略.在所选的各因素水平范围内，按照对结果的影响排序：C>A>B，即：硫酸铵质量>萃取温度>聚乙二醇体积分数.

表3 响应面方差分析

方差来源平方和自由度均方F值P值显著性模型530．22958．9193．31<0．0001∗∗A7．9417．9412．580．0165∗B4．2914．296．800．0478∗C24．82124．8239．310．0015∗AB0．2210．220．340．5838AC3．600×10-313．600×10-35．702×10-30．9427BC0．1310．130．210．6653A213．31113．3121．070．0059∗B244．74144．7470．860．0004∗C2464．681464．68736．00<0．0001∗∗残差3．1650．63失拟项3．0031．0012．780．0734误差0．1620．078总和533．3814

注：**P<0.0001 为差异极显著； 0.01<*P<0.05，为差异显著.

2.2.2等高线与响应曲面分析

为了更直观地表现两个因素对铁的量的影响，可以令其他因素水平值为零，即以萃取温度、聚乙二醇体积分数、硫酸铵质量3个因素中一个因素取零水平时，另两个因素对铁含量的影响进行分析.利用Design-Expert 7.0 软件做出各因素交互作用对响应值影响的等高线与响应曲面图，如图2所示.B(聚乙二醇体积分数)和C(硫酸铵质量)、A(萃取温度)和C(硫酸铵质量)两组对应的等高线呈扁平或椭圆状，且响应曲面比较陡峭，响应值变化较大，表明这两组因素间的交互作用比较大；A(萃取温度)和B(聚乙二醇体积分数)等高线接近圆形，响应曲面相对比较平缓，说明因素间交互作用较弱.虽然图2(B)(C)中对应响应曲面较为陡峭，但三个模型综合分析表明两因素间的交互作用不大.另外，响应曲面均为开口向下，响应值随着每个因素的增大而增大，当增大到极值点后，它又随着因素的增大而逐渐减小.这个结果说明此模型在所取范围内有稳定点，且这个稳定点是响应面的最高点，也是等高线椭圆的中心点.

2.2.3实验优化及验证

由Design-Expert7.0 软件分析得到的最大响应值对应的最佳条件为萃取温度为37.31 ℃，聚乙二醇体积分数为14.42%，硫酸铵的质量为7.92 g.理论铁的量为71.48 mg/kg.为验证理论预测值与实际情况的一致性，在此条件下进行3次重复验证试验，得到的铁含量为(71.48±3.6)mg/kg，与理论预测值基本吻合，说明采用响应面法优化的工艺参数是准确可靠的，具有一定的实用价值.

2.3 样品铁的量的测定结果

选定双水相萃取和国标方法分别对食品中的铁元素进行测定，结果见表4、5.

表4 双水相法测量样品的吸光度和铁的量

样品名称第1组第2组第3组AX/(mg·g-1)AX/(mg·g-1)AX/(mg·g-1)香菜0．0950．0690．0970．0790．0940．065黄豆0．0890．0400．0900．0450．0920．055猪肉0．0840．0160．0840．0160．0850．022苹果0．0820．0070．0820．0820．0830．011红豆0．0870．0310．0890．0410．0870．031

表5 国标法测量样品中的吸光度和铁的量

样品名称吸光度铁的量/(mg·g-1)香菜0．0900．046黄豆0．0850．021猪肉0．0820．007苹果0．0810．002红豆0．0830．011

由表4、5可以看出，在含铁量的测定中，各称取了质量为1.200 g样品进行实验，观察双水相萃取与国标方法测定样品铁的量：测定出香菜的铁的量分别为0.065 mg/g和0.046 mg/g，黄豆的铁的量为0.055 mg/g和0.021 mg/g，苹果的铁的量为 0.011 mg/g和0.002 mg/g，猪肉的铁的量为0.022 mg/g和0.007 mg/g，红豆的铁的量为0.031 mg/g和0.011 mg/g，根据实验结果分析可知：虽然双水相方法较国标法来说步骤比较繁琐，但是得到的结果比较可观，因为用双水相方法测得的铁的量结果远远大于国标方法.

图2 各两因素交互作用对含铁量影响的响应面和等高线图

2.4 回收率的测定结果

采用加标的方法测定回收率，实验分为两组，其中一组加入0.05 mg标准样品，但条件和操作一样进行，根据公式测得样品的回收率，结果如表6.

表6 样品的回收率

样品名称样品含铁量/(mg·g-1)加入铁标量/(mg·g-1)样品+铁标铁含量/(mg·g-1)回收率/%香菜0．0690．050．122106黄豆0．0400．050．08896猪肉0．0160．050．06495苹果0．0710．050．05596红豆0．0310．050．079296

由表6可知，实验回收率的结果分别是106%、96%、95%、96%、96%，介于95%～106%之间，符合回收率的误差范围之内，实验数据较为合理.

3 结 语

本文在单因素试验基础上，应用响应面设计对双水相法测定食品中铁含量的工艺条件进行优化，得到最佳条件萃取温度为37.31 ℃，聚乙二醇体积分数为14.42%，硫酸铵的质量为7.92 g.理论铁的量为71.48 mg/kg.建立了萃取温度、聚乙二醇体积分数以及硫酸铵的质量与铁量的二次多项式回归模型，且模型经验证可靠合理.通过双水相方法和国标方法测定样品中的铁量，双水相方法测得的铁的量结果远远大于国标方法.实验回收率的结果介于95%～106%之间，符合回收率的误差范围之内，实验数据较为合理.因此，采用响应面设计优化双水相法测定食品中铁的量稳定可行，对生产实践有一定的指导意义.

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Optimization of aqueous two-phase method for determination of iron content in food by response surface methodology

CHEN Ting-ting1, CHEN Lin-lin2

(1. School of Pharmacy, Heilongjiang University of Traditional Chinese Medicine, Harbin 150040, China;2. School of food Science and Engineering, Harbin University of Commerce, Harbin 150076, China)

The aqueous two-phase method for the determination of iron content in food process conditions were optimized by response surface method. With the extraction yield of iron as an experimental index, the effect of operating conditions such as extraction temperature, concentration of polyethylene glycol and (NH4)2SO4quality were investigated. Three-factor three-level experiment based on response surface analysis method was applied to optimize the extraction conditions, and the simulated regression equation of prediction model was established. The most suitable situation was determined: the extraction temperature was 37.31 ℃; the concentration of polyethylene glycol was 14.42% and (NH4)2SO4quality was 7.92 g. Under the optimized conditions, the theoretical value of iron content was 71.48 mg/kg, and the experimental value was (71.48±3.6)mg/kg, which was almost consistent with the theoretical value. Results showed that the application of RSM for the optimization of aqueous two-phase method for determination of iron content in food was accurate, reliable and also has certain practical value. To prove the rationality of the experiment, the recovery results were between 95%～106% that are within the error range, which means it is a better way to determine the iron content in food.

iron; aqueous two-phase extraction; spectrophotometry; response surface methodology

2014-12-07.

哈尔滨市应用技术研究与开发项目(2014RFQXJ115)；哈尔滨商业大学博士科研启动项目(12DL010)

陈婷婷(1982-)，女，硕士，讲师，研究方向：应用统计学.

TS207

A

1672-0946(2015)06-0644-06