分光光度计法测量氨基聚醚的专属性

张锦明，陈征宇，武向峰，张晓军，朱 华，周 明，杨 志

(1.解放军总医院 核医学科，北京 100853；2.总后勤部卫生部药品器材局，北京 100842；3.解放军总后药品检验所，北京 100071；4.北京肿瘤医院 核医学科，北京 100036)

分光光度计法测量氨基聚醚的专属性

张锦明1，陈征宇2，武向峰3，张晓军1，朱 华4，周 明1，杨 志4

(1.解放军总医院 核医学科，北京 100853；2.总后勤部卫生部药品器材局，北京 100842；3.解放军总后药品检验所，北京 100071；4.北京肿瘤医院 核医学科，北京 100036)

氨基聚醚(K2.2.2)含量是18F-FDG质控中的关键指标，比较了两种常用测量K2.2.2方法的专属性。分别采用分光光度计和半定量TLC 碘显色法测量了14个样品，其中9个阴性样品、2个阳性样品和3个供试品，并与LC-MS/MS测量对比。结果显示：9个阴性样品经分光光度计法测量均为阳性，K2.2.2的测量结果在6.7～470.0 μg/mL；2个阳性样品结果偏高(53，73 μg/mL)，3个供试品的K2.2.2含量在14.3～19.2 μg/mL；半定量TLC 碘显色法测量9个阴性样品结果为阴性,2个阳性样品半定量结果与实际一致,3个供试品的K2.2.2含量低于10 μg/mL;LC-MS/MS法测量的14个样品的结果与半定量TLC 碘显色法的结果一致。以上结果表明，半定量TLC 碘显色法测量K2.2.2的专属性较好，适用于测量18F-FDG溶液中K2.2.2含量。

分光光度计法；氨基聚醚；TLC；液质联用；专属性

氟-18标记的正电子放射性药品质量控制的一个关键指标为氨基聚醚(K2.2.2)含量，为了方便、准确测量K2.2.2的含量，文献报道了多种测量K2.2.2的方法[1-3]。美国和欧洲的药典规定18F-FDG中K2.2.2含量不高于50 μg/mL，测量方法为半定量TLC 碘显色法，我国药典2014年5月20日关于18F-FDG国家标准草案中K2.2.2含量不高于25 μg/mL，测量方法为紫外分光光度计法[4]。本研究为证实紫外分光光度计法的专属性，选择了阴性样品(加入了制备18F-FDG过程中可能存在的其他杂质和辅料),阳性样本(K2.2.2标准溶液)和供试品(18F-FDG注射液)进行测量，与半定量TLC 碘显色法比较，测量结果经LC-MS/MS证实[5]，以验证半定量TLC 碘显色法和分光光度计法的专属性。

1 实验方法

1.1 试剂与设备

K2.2.2和三氟甘露糖,AR：江苏华益科技有限公司;无水乙腈,AR：美国Aldrich公司;SEP-PAK C-18柱,SEP-PAK Al2O3柱：美国Waters公司;IC-H柱：美国Alltech公司;Dowex-50树脂：美国Bio-Rad公司;碘：Sigma 公司；18F-FDG注射液原液,按文献方法[6]纯化和制备。

Nanodrop2000：美国 Thermo Scientific公司；TLC显色缸：自制;TLC板：Flexible Plates For TLC,PE SIL G/UV,Whatman，裁成5 mm×100 mm备用;API 2000 LC-MS/MS串联液质联用仪：美国ABI Sciex公司；Sony α200(1 020万像素)：日本Sony公司。

1.2 测量样本

14个被测试样品(均在解放军总医院核医学科制备)，其中有9个阴性样本，2个阳性样品，3批供试品。

(1) 阴性样本

2号样品:10 mL,先用12 mL注射用水洗IC-H柱,再10 mL注射用水流经该柱后收集液；3号样品:2 mL,2 mL注射用水流经IC-H柱后收集液；5号样品:10 mL,等体积的0.5 mol/L柠檬酸钠溶液与0.5 mol/L NaOH混和液;6号样品:10 mL注射用水;10号样品:10 mL, 先用2 mL注射用水洗IC-H柱,再10 mL注射用水流经该柱后收集液；11号样品:10 mL,自行称取得Dowex-50 1.5 g装于空柱壳中, 取10 mL注射用水流经该Dowex-50柱 后的收集液；12号样品:10 mL,10 mL注射用水流经Al2O3柱后收集液；13号样品:10 mL,10 mL注射用水流经C-18柱后收集液；14号样品:10 mL,取20 g三氟甘露糖(华益),用2 mL乙腈溶解,再加入8 mL水。

(2) 2个阳性样品

8号样品:10 mL,标准K2.2.2溶液的浓度为30.0 μg/mL；9号样品:10 mL,标准K2.2.2溶液的浓度为10.0 μg/mL。

(3) 3批供试品

取3批18F-FDG注射液原液，在制备一周内经衰变后测量，分别为4号(20140722)、7号(20140723)和15号(20140722P)。

1.3 测量方法

1.3.1 紫外分光光度计法 配制标准K2.2.2溶液, 采用Nanodrop2000型分光光度计进行测量。工作曲线的线性范围在5～50 μg/mL,用该工作曲线测量14个样本，超过50 μg/mL的样本稀释后测量[1](紫外分光光度计的标准曲线与测量在北京肿瘤医院核医学科完成)。

1.3.2 半定量的TLC碘显色法 配制标准K2.2.2溶液(100.0、50.0、25.0、10.0 μg/mL),点样100 μL于TLC板, 晾干，置于层析缸内进行层析，展开剂为V(甲醇)∶V(氨水)=90∶10，展开到前沿95 mm至100 mm， K2.2.2的Rf值为0.3～0.4。层析后用热空气吹干，放置在TLC显色缸内用碘蒸气显色，目测结果，并用数码相机摄像记录。该法用于14个样本测量，每个样品点样体积均为100 μL，显色结果摄像记录[7]。

1.3.3 LC-MS/MS法 配制标准K2.2.2溶液, 用于制备LC/MS/MS的标准曲线, 测量保留时间5.1 min 处的峰面积与K2.2.2含量的线性。工作曲线的线性范围1 000～3 000 ng/mL, 用该工作曲线测量14个样本, 超过3 000 ng/mL的样本稀释后再进行测量[5]。

2 实验结果

2.1 分光光度计法

在253 nm下， 浓度与吸光度的标准曲线为y=0.000 980x+0.003 447,相关系数为0.997。 用该标准曲线计算14个样品，结果见表1。 其中9个阴性样品均测量到了紫外吸收，经标准曲线计算K2.2.2含量的范围在6.7 μg/mL～470.0 μg/mL之间, 其中以柠檬酸缓冲液、Dowex 50淋洗液和三氟甘露糖溶液的测量值最高,IC-H柱和Al2O3柱淋出液结果也较高。2个阳性样品结果高于实际含量, 约高出40 μg/mL。3个供试品的测量值从14.3 μg/mL到19.2 μg/mL, 其含量低于我国规定的25 μg/mL[4]。

2.2 半定量TLC 碘显色法

采用半定量的TLC 碘显色法，先分别测量100.0、50.0、25.0、10.0 μg/mL四个标准K2.2.2溶液，均可以明显目视观察到染色，且随浓度增加，染色度增加(图1)。

表1 14个样品来源及三种测量方法的测量结果Table 1 The source of 14 samples and the results of the three methods for K2.2.2

注：1) 为没有显色斑点

再用相同方法测量以上14个样品，结果示于图2。由图2可见，8号和9号测出了K2.2.2，其余均没有测到斑点，其中8号显色斑点明显强于标准板上的25.0 μg/mL，而9号斑点弱于标准板上的25.0 μg/m，强于10.0 μg/mL。 5号样品原点有一斑块,但经展开剂展开后,该斑块没有移动,说明不是K2.2.2。此外，11号也有一点样斑，同样没有移动。因此可以认为这些没有显色的样品，其K2.2.2含量低于10.0 μg/mL。

图1 TLC 碘显色法半定量测量K2.2.2阳性样品结果Fig.1 Iodine-vapor TLC for semiquantitative measured K2.2.2 in positive samples

2.3 LC-MS/MS法

用LC-MS/MS绘制标准曲线,标准曲线为y=109x+1.93E+005, 线性相关系数为0.999。依据该曲线,分析14个样品，结果如下：9个阴性样品在固定保留时间5.1 min处的峰面积经计算小于1 μg/mL;2个阳性样品的K2.2.2分别为26.89 μg/mL和10.9 μg/mL,与实际含量相差不大；而三批供试品测量K2.2.2的含量均低于1 μg/mL。

2.4 结果比较

2.4.1 9个阴性样品的测量结果

分光光度计法测量9个不含K2.2.2的溶液，均测量到了紫外吸收，并将之换算成K2.2.2，其中以柠檬酸钠缓冲液和前体的乙腈溶液最高。 半定量的TLC 碘显色法和LC-MS/MS法均没有测量到K2.2.2。

图2 TLC碘显色法半定量测量14个样品K2.2.2结果Fig.2 Iodine-vapor TLC for semiquantitative measured K2.2.2 in 14 samples

2.4.2 2个阳性样品的测量结果

2个阳性样品溶液(K2.2.2含量10.0 μg/mL,30.0 μg/mL)，以上三种方法均测量到了K2.2.2。分光光度计法结果偏高, 半定量的TLC 碘显色法可半定量测出，而LC-MS/MS法的结果与实际最相近。

2.4.3 3批供试样品的测量结果

分光光度计法测三批18F-FDG注射液的K2.2.2含量分别为14.3、15.3、19.2 μg/mL，但半定量的TLC 碘显色法没有显色斑点，K2.2.2低于10.0 μg/mL; LC-MS/MS法经特定保留时间内吸收峰计算, 3批供试样品中K2.2.2含量均低于1 μg/mL。

3 讨论

紫外分光光度计测量18F-FDG中K2.2.2含量是依据K2.2.2在pH 6.4 的柠檬酸-氢氧化钠缓冲液介质中与Pb(II)形成稳定的络合物，在波长253 nm有最大吸收，显色后，其吸光度立即达到最大值，显色稳定，重现性好[1]。文献[7]考察了分光光度计法的准确度、精密度、测量限和定量限，但未见文献研究该方法的专属性,文献[3]在对比紫外分光光度计与HPLC法测量样品中K2.2.2时发现, 紫外分光光度法测定K2.2.2时，存在干扰，使测量结果偏高。

目前18F-FDG制备均采用以三氟甘露糖为前体与氟-18亲核取代反应，经酸水解或碱水解后经吸附(Dowex50)或中和pH(IC-H柱或柠檬酸钠)后，经纯化柱(C-18柱和Al2O3柱)除杂质，过无菌滤膜即可[6-8]。在制备过程中使用了多种试剂和纯化柱，在测量K2.2.2时，一定要考虑试剂和辅料对K2.2.2测量的影响。本研究设计了强阳离子交换树脂IC-H和Dowex50淋洗液、纯化柱C-18柱和Al2O3柱淋出液、20%乙腈溶解的三氟甘露糖,以及柠檬酸缓冲溶液作干扰剂。结果表明：以上杂质或辅料均影响了紫外分光光度计的结果,分光光度计测量依据样品在253 nm下吸收,并将之全部转化计算为K2.2.2。制备18F-FDG过程中所用的强离子交换树脂 Dowex 50和IC-H柱会脱色，淋洗树脂水液体有一定的颜色, 这些颜色在253 nm下有吸收。同时发现, 随IC-H淋洗体积(次数)的增加(2号与3号样品比较)而干扰减小, 说明纯化柱在使用前应用足够的水冲洗以减少其他杂质。 C-18柱和Al2O3柱淋洗液干扰可能是淋洗液中小颗粒物，而20%乙腈溶解的三氟甘露糖影响可能是有机溶剂或三氟甘露糖的的影响。测量体系本身为柠檬酸缓冲溶液,5号样品中0.25 mol/L柠檬酸钠溶液本身产生的紫外吸收使测量值偏高所致。以上因素对半定量TLC 碘显色法和LC-MS/MS均没有干扰, 半定量TLC 碘显色法和LC-MS/MS采用了适当的分离方法, 将干扰剂分开，如TLC发现5号和11号样品在原点有显色，由于K2.2.2的迁移，可以排除干扰。

本研究采取了供试样与测量由两个单位完成，因此造成了阳性样品紫外分光光度计测量结果偏差较大，总体结果偏高，可能与标准品的来源和批号等因素有关。

分光光度计测量三批供试品(18F-FDG注射液)中K2.2.2含量均在25 μg/mL以下(14.3、15.3、19.2 μg/mL), 该结果同中国药品食品检定研究院测量本院其他三批18F-FDG一致(13、11、16 μg/mL)。半定量TLC 碘显色法和LC-MS/MS测量三批供试品的结果低于分光光度计, 文献[3]也发现了HPLC法测量K2.2.2的结果低于分光光度计，供试品中存在的干扰物质造成了分光光度计测量结果偏高。从阴性样品、阳性样品和供试品的测量结果说明，紫外分光光度计测量K2.2.2方法专属性差。我国药典2014年12月4日再次公示的18F-FDG国家标准草案中，将K2.2.2测量方法由紫外分光光度计法改成了氯铂酸/碘化钾显色法[9]。

碘蒸气显色法采用层析分离后的有机化合物吸附碘蒸气较多，引起有机化合物斑点颜色较浓，而TLC 背景颜色为淡黄色，通过对比标准液的显色斑点颜色即半定量测量样品K2.2.2含量。方法简单, 特异性高、结果可靠。前期研究发现如果点样体积小，会出现假阴性，为了保证结果的可重复性，点样体积最好固定在100 μL，同时从染色缸内取出TLC板后立即照相，以防止碘挥发而退色。从本研究的对比实验发现, 半定量TLC 碘显色法专属性较好,结果可靠但点样体积偏大。虽然我国新的18F-FDG标准中K2.2.2残留测量为氯铂酸/碘化钾显色法，但文献认为氯铂酸/碘化钾显色法特异性差，可能存在假阳性。如果氯铂酸/碘化钾显色法测量结果存异义时，建议采用碘蒸气显色法复核[10]。

4 结论

紫外分光光度计法测量18F-FDG中的K2.2.2含量的专属性差，干扰因素多，结果不可靠，不适于常规18F-FDG的质量控制；半定量TLC 碘显色法专属性强，方法简单，结果可靠，可考虑用于常规18F-FDG的质量控制。

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Specificity of the Spectrophotometry for Detecting Aminopolyether K2.2.2in18F-FDG

ZHANG Jin-ming1, CHEN Zheng-yu2, WU Xiang-feng3, ZHANG Xiao-jun1, ZHU Hua4, ZHOU Ming1, YANG Zhi4

(1.DeptofNuclMed,ThePLAGeneralHopspital,Beijing100853,China；2.DrugandMedicalEquipmentAdministrationBureauofHealthDepartment,Beijing100842,China；3.DrugandMedicalEquipmentInspectionInstritueofHealthDepartment,Beijing100071,China；4.DeptofNuclMed,PekingUniversityCancerHospital,Beijing100036,China)

The residue of K2.2.2was one of the key metric in18F-FDG quality control. The specificity of the spectrophotometry for K2.2.2was compared with others. Methods: The 14 samples were determined for the K2.2.2by the spectrophotometry and iodine-vapor TLC stain method, respectively. The results were compared with LC-MS/MS. The spectrophotometry showed that the 9 of negative samples were false positive , 2 of positive samples were higher than its actual K2.2.2contents, 3 of18F-FDG injections contained 14.3-19.2 μg/mL for K2.2.2. The iodine-vapor TLC stain method showed that 9 of negative samples were negative, 2 of positive samples were the same with its K2.2.2contents, 3 of18F-FDG injections were lower than 10 μg/mL with K2.2.2. The iodine-vapor TLC stain results were confirmed by the LC-MS/MS. Results: The specificity of spectrophotometry was poor for K2.2.2. The iodine-vapor TLC stain was simple and good specificity method for K2.2.2in18F-FDG injections.

spectrophotometry; aminopolyether; TLC; LC-MS/MS; specificity

10.7538/tws.2015.28.03.0129

2015-01-20;

2015-04-01

军队医疗机构制剂标准提高项目(14ZJZ21-1)

张锦明(1965—)，男，博士，主要研究新型正电子放射性药物的合成和应用

TL92+3

A

1000-7512(2015)03-0129-06