低温保存对4种作物种子超弱发光特性影响规律的研究

张文兰　田茜　李群　贾文斌　戴双　段乃彬

摘要：为探索超弱发光特性（UWL）与种子活力之间的相关性，并为研究种子活力无损测定新方法提供技术依据，对不同保存年限的玉米、小麦、大豆、水稻种子进行超弱发光和延迟发光测定，并通过数据统计、曲线拟合及作图，分析种子超弱发光特性与低温保存时间的关系及延迟发光的变化特征。结果表明，同一品种不同保存年限的种子超弱发光能力差异明显，随保存延长超弱发光强度逐渐下降，与发芽势变化呈现极强的正相关；种子的延迟发光呈现随贮藏年限延长强度降低而衰减系数先增大后减小的特征。

关键词：低温保存；作物种子；超弱发光；种子活力

中图分类号：S510.1文献标识号：A文章编号：1001-4942（2014）12-0038-05

种子活力检测方法的种类多达数十种，归纳起来不外乎直接法和间接法，即通过发芽试验测定田间出苗率的方法和生化方法，这些方法繁琐、耗时长，会破坏组织以及物理、化学结构，且要求操作人员具备较高的专业操作水平，属有损检测方法。特别对于稀有种子，发芽试验测定将造成不可挽回的资源损失，因此在种质资源保存领域需要一种快速、高效、无损的种子活力检测方法。

生物组织或细胞在生命活动的代谢过程中，都自发地辐射出一种极其微弱的光子流，这是一种极微弱的准连续光子辐射[1]，是生物在生命活动中出现的一种机体自身发光，其强度为每秒每平方厘米上几个至几千个光子，波长180～800 nm，称为生物系统的代谢超微弱发光（Ultra-Weak Luminescence，UWL），是所有活的生物都具有的一种普遍现象[2]。生物代谢的超弱发光广泛存在于动植物中，反映了生物体与生命活动过程的有关信息。生物超弱发光通常包括两部分：一种为自发的超微弱发光，与生物体的代谢有关；另一种为外因诱导发光称为延迟发光（Delayed Luminescence，DL），如光、电离辐射、超声、化学药物等外界激励因素。自身发光和延迟发光与生物的新陈代谢状态和水平，细胞的分裂、死亡、变异以及细胞间信息的传递等许多基本的生命过程都有着内在的联系，是反映生物体内部机能的一个重要窗口[3]。基于以上，通过超微弱发光特性检测种子基础代谢（反映种子的活力）与保存时间的关系，在不破坏被检测种子的物理和化学结构情况下，对种子进行无损、快速检测，将为种质资源的安全保存与及时更新提供更为准确的技术依据[4，5]。

1材料与方法

1.1试验材料

从种子资源库（中期库）选取玉米郑单958、小麦济南16、大豆齐黄27、水稻香粳9407共4种作物种子，其保存时间分别为1、3、5、7、9年，保存温度为0℃。种子由中国农业科学院种质资源研究所国家种质中期库提供。

1.2试验方法

1.2.1发芽势及发芽率的测定取以上玉米、小麦、大豆、水稻净种子，按照《农作物种子检验规程》（GB/T 3543.3-1995）操作规程进行发芽试验，统计发芽势和发芽率。

1.2.2自身发光的测量从0℃中期库中取出种子，置于4℃保鲜箱中24 h缓慢升温，再置于25℃生化培养箱中缓慢升温并保持恒温，使之不因升温破坏种子的基础代谢，尽量保持种子保存时的自然状态。每个保存年限的种子样品分成3个平行组，其中玉米每组10粒、小麦50粒、大豆15粒、水稻70粒，以便使种子数量能够完全覆盖测量杯底并略有盈余。在进行试验前种子先置于暗室中30 min，取出后放入BPCL-2-ZL超微弱发光测量仪样品室的测量杯中进行自身发光的测定，时间为100 s，取每种样品3个平行组测量数据的平均值作为该样品的测量值，样品室温度设定为恒温25℃。

1.2.3延迟发光的测量由于自身发光主要反映种子的基础代谢特征，这对于判断种子活力并不全面，本试验进一步测量了种子的延迟发光特征。前人的研究发现新鲜种子采取的激励方法是日光灯或LED灯珠照射，照度只有几十勒克斯[7]。而本试验是经过较长时间保存的种子，较低的照度显然不足以对样品产生足够激励，为深入研究种子对外界激励的响应，需要较强的“唤醒”信号，故选择波长较宽的日光灯为光源，光照强度为4 000 lx。样品分组方式与自身发光测量相同，将待测样品依次放在日光灯下照射2 min后，迅速测定延迟发光光子数，每次测量100 s，样品室设定为恒温25℃。

2结果与分析

2.1发芽率、发芽势测定结果

由图1可知，玉米、小麦、大豆、水稻4种作物种子的发芽率随保存时间的延长逐渐降低，降低趋势一致，保存1～7年间缓慢降低，7年后显著降低。以玉米种子为例，保存1年的种子发芽率为97%，保存3、5、7、9年后的发芽率分别降低为96%、95%、93%和86%。

4种作物种子发芽势降低趋势也接近一致。图2反映出发芽势的降低幅度比发芽率大。以小麦为例，保存1年后种子发芽势为99%，保存3、5、7、9年后分别降低为95%、90%、78%和70%。

以上结果表明，在中期库保存对4种作物种质生活力变化趋势的影响是一致的，同时说明，在中期库保存过程中，玉米、小麦、水稻和大豆的耐贮性相差不大。

2.2自身发光检测结果分析

超微弱发光的测试及数据处理是一个比较复杂的工作，这是由于数据本身跳变性较大，直接作图往往难以提取有用的信息，有些研究者做了很多有益的尝试，效果很好[6～15]。本试验采用更直观的方式，发现效果更好。方法是将同一样品而保存年限不同的种子，取其100 s 内的总光子数除以总粒数和总测量时间，即单位时间单粒种子在一定测量时间内的平均自身发光光子数（S）。

S=Nn×t

式中：t为100 s，N为总光子数，n为种子粒数。

将测得的4种作物各5个保存年限种子的自身发光光子数用OriginPro 8.0作图3。可以看出，同种种子随保存时间的不同，其自身发光S存在明显差异，总体上是随保存时间的延长而减弱，这一结果与种子的新陈代谢以及活性规律相吻合，表明种子活性与保存时间之间具有负相关性。同时还可以看出不同种子存在明显差异，这可能与种子本身的特性，如种子大小、形状以及胚所在位置有关。在大豆的发芽势（活力）与超弱发光变化上，在前期有一个明显的平台，即保存第1～3年两个指标均变化较小，保存第3～5年以后则急剧下降。这直接证明了种子超弱发光可以作为衡量种子活力的重要指标。由DPS数据分析软件对4种作物发芽势及超弱发光数据进行相关分析表明，两组数据之间存在极强的正相关（表1），4种作物两者的相关系数分别为玉米0.97、小麦0.99、大豆0.98、水稻0.96，相应P值均小于0.01，表明差异达极显著水平。

2.3延迟发光结果分析

由于超弱发光测量数据的特殊性，对所得数据进行分析处理，获得尽可能多的信息，目前没有统一的方法。经比较分析发现，延迟发光的拟合曲线，同样可反映种子的活力。而延迟发光衰减所呈现的规律性，往往受到诸多偶然因子及系统因子的影响，需要进行修正。将玉米、小麦、大豆、水稻种子在100 s内的延迟发光测量数据，用OriginPro 8.0直接作图，并对延迟发光曲线进行拟合处理，得到各自的拟合曲线为图4、图5、图6和图7。

从拟合曲线中可知，种子的延迟发光光子数随着保存时间的延长而增大，符合双曲线特性。以大豆为例，延迟发光的拟合曲线呈现出明显的层次性，保存年限对拟合曲线的特征影响明显；另一个特征是保存时间长的种子趋向稳态的时间明显高于保存时间短的种子，即其恢复到自身发光水平所需的时间更长，表明种子的活性与保存时间在延迟发光方面有密切关联。这种现象的原因可能在于种子遭受外界环境干扰时（光照），要靠自身的新陈代谢来修复，保存时间短的种子可能快速修复完毕，而保存时间长的种子仍在进行旺盛的新陈代谢来修复细胞基础代谢，导致保存时间长的种子发光强度都比新种子强。水稻、玉米的情况亦如此，只有小麦的拟合曲线略有不同，表现为保存7年的种子，其延迟发光拟合曲线在开始衰减的20 s左右，略高于保存9年的种子的拟合曲线，但总趋势与其它品种相同。进一步分析发现，保存1年种子的延迟发光曲线总体明显低于其它4个保存年份，其它4个年份的延迟发光曲线趋势区分度较好，可以推测，种子保存过程中，在短时间内种子活性会有所降低，随着保存时间的推移，种内的新陈代谢等活动会达到相对稳定的状态，玉米、小麦、水稻亦如此。

2.4延迟发光衰减规律——双曲线方程的修正

延迟发光拟合曲线不仅可以很好地反映种子的活力，而且还可以提供更多的信息。研究表明，植物叶片经白炽灯光照诱导后的发光衰减特性接近双曲线规律，与生物光子的相关理论相吻合，因此这一结果在超弱发光理论的争论中有力地支持了Popp等[9]的相关理论。双曲线衰减方程为：

Y=A+BX是一线性方程，理论上来说应该是一条直线，但是试验结果虽然大体上是一条直线，其前一段却呈一开口向上的曲线，用曲线方程Y=p1e-x/p2+p3X+p4C拟合试验数据。对曲线方程做数学处理，由Y=p1e-x/p2+p3+p4X，得：

Y=p3+p4（1+p1p4×e-x/p2X）X

式中X=ln（t-t0），对上式两边求e指数：

I（t）=ep3·（t-t0）p4（1+p1p4·e-x/p2X）

令p4（1+p1p4·e-x/p2X）=-1p（t）；可得出：

p（t）=B（t-t0）ln（t-t0）（t-t0）ln（t-t0）-C

所以延迟发光拟合曲线方程为

I（t）=A（t-t0）-1/p（t）

其中，生物系统内部各个激发态分子之间是相互偶联的，延迟发光衰减参数1/p表征生物体内各个激发态偶联程度和生物体系统内相互作用的大小[16]。一个重要问题在于本课题研究的种子，不含有如叶片那样的专门用于光吸收的分子体系（如叶绿素分子及天线色素系统及相关酶系）和物质结构（如叶绿体和类囊体等）[17]。衰减参数是否对本课题的样品适用呢？通过拟合曲线方程，可以比较方便地求出衰减参数，作图后发现保存年限也与衰减参数存在相关性，但是关系较复杂，如图8所示。表现为在1～5年间衰减参数随保存时间延长而增大，5年时达到最大，随后减小。由于衰减参数相对于自身发光及延迟发光的测量而言，是以拟合曲线方程为前提的，经模拟处理后，可能会造成信息的丢失，因此虽然衰减参数与保存时间并不呈现为简洁的关系，但是它们之间的关联性，使得衰减参数仍可以作为检测种子活力的辅助参数。

由于测量样品数量还不太丰富，同时旁证材料较少，相关的分析有待于进一步深入研究。

3结论

通过测量4种作物种子的20个样品的自身发光和光照诱导条件下的延迟发光特性，用作图和曲线拟合分析试验数据，发现储藏时间会导致玉米、小麦、大豆、水稻种子组织结构及生理生化上的变化，相应地反映在其自身发光强度和延迟发光变化上。

在自身发光（UL）方面，保存的时间越长，种子自身的发光强度越弱，体现了它们之间的负相关性，单位时间单粒种子的平均自发光子数，可很好地反映种子的新陈程度，这可作为无损伤检测种子保存时间的主要指标。

在延迟发光（DL）方面，保存时间的不同会导致延迟发光特性的差异。在强光激励对种子“唤醒”后，保存时间长的种子趋向稳态的时间要明显高于保存时间短的种子，表明了它们之间的正相关性。这种特性可以很好地将延迟发光作为反映种子内部新陈代谢变化的一个窗口，拟合曲线能够很好地反映种子的活力，衰减参数也与保存时间存在关联性，可作为无损伤检测种子活力的辅助参数。

总之，相对于传统检测方法及其它有损伤检测，自身发光和延迟发光方法可以很好地反映种子活力，这对于提高检测效率，降低种子损耗，是一种有效快速简便的方法。

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