梨属野生种质资源SRAP—PCR反应体系优化研究

梁婷婷　马燕　臧德奎

摘要：采用正交直观分析法和新复极差法对影响梨属野生种质资源SRAP-PCR反应的5种因素（Mg2+浓度、dNTPs浓度、引物浓度、Taq DNA聚合酶、模板DNA）4个水平进行优化筛选。结果表明，优化后的梨属SRAP-PCR反应体系为25 μL，包括10×PCR buffer 2.5 μL，2.0 mmol/L Mg2+，200 μmol/L dNTPs，0.4 μmol/L引物，1.5 U Taq酶，60 ng模板DNA。

关键词：梨属；SRAP-PCR；正交直观分析法；新复极差法

中图分类号：S661.201文献标识号：A文章编号：1001-4942（2014）12-0007-04

目前相关序列扩增多态性（Sequence-related amplified polymorphism， SRAP）技术已在多种果树、蔬菜以及大田作物中得以使用，并以其多态性丰富、简单、易测序[1]等优点应用于遗传多样性分析[2]、遗传图谱构建[3]、亲缘关系分析、种质资源鉴定以及比较基因组学等诸多研究领域。

正交PCR试验是基于统计学原理，研究各影响因素不同水平间交互作用的一种方法[4]，具有均衡分散和整齐可比的特点，可以简便、快速地找到反应体系的最佳组合[5]。正交直观分析法正是基于PCR正交设计试验的一种结果判断方法，即根据扩增条带的明亮度、特异性及数量的多少进行不同的分数判断，分数越高则表明扩增效果越好。新复极差法（SSR）是方差分析的进一步分析，用于多种因素对某一结果影响的各个因素之间的显著性分析。

目前基于正交设计法的SRAP-PCR技术已在辣椒、石榴等物种的相关研究中得以应用[6，7]。本试验采用正交设计法对梨属野生种质资源SRAP-PCR反应体系进行优化，并通过正交直观分析法和新复极差法，更直观快速地找到梨属SRAP-PCR反应体系的最佳组合，以期为梨属野生种质资源的开发利用与保护提供基础技术支持。

1材料与方法

1.1试验材料

供试材料为秋子梨（Pyrus ussuriensis）、褐梨（Pyrus phaeocarpa）、河北梨（Pyrus hopeiensis）、杜梨（Pyrus betulaefolia）、崂山梨（Pyrus trilocularis）。4月中旬于山东崂山、蒙山等地采集用于提取DNA的幼叶样品，幼叶采集后硅胶干燥保存。

1.2试验方法

1.2.1试剂和仪器DNA扩增采用Bio-Rad PCR仪，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后在北京六一WD-9403CS型紫外仪上采集图像。试验所用引物由TaKaRa合成；用于PCR反应的Taq DNA聚合酶、Mg2+、dNTPs和Buffer均购自TaKaRa公司。

1.2.2样品基因组DNA的提取梨属样品基因组DNA的提取采用改良的CTAB法[8]。基因组DNA质量的检测采用琼脂糖凝胶电泳法和核酸蛋白分析仪。

1.2.3PCR反应体系的正交试验试验采用L16（45）正交表设计，对影响扩增结果的5因素进行4水平共16个组合的筛选，各体系模板均为秋子梨样品，所选引物为随机Me5/Em11（序列见表3）组合，PCR反应体系总体积设为25 μL，每组合按其浓度计算加样量，并包含10×PCR buffer 2.5 μL，不足部分用超纯水补足。试验各因素水平见表1，正交试验设计见表2。

PCR反应扩增程序：94℃预变性5 min；94℃变性1 min，35℃退火1 min，72℃延伸1 min，循环5次；94℃变性1 min，50℃退火1 min，72℃延伸1 min，循环30次；72℃延伸7 min，4℃保存。扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳分离，20 μL上样，电压120 V电泳90 min，电泳缓冲液为1×TAE，经溴化乙锭（EB）染色后，在紫外仪上采集图像。

PCR扩增结果分析参照何正文等[9]的直观分析法，即对各组合扩增出来的条带分别进行分数判定，分数等级设为3、2、1、0分。判定评分后再参照王军[7]、刘萌芽[11]等的方法，运用新复极差法对试验数据进行分析。

1.2.4体系稳定性检测随机选用6对引物组合对褐梨、杜梨、河北梨、崂山梨 4个野生种进行PCR扩增，经电泳观察结果。所用引物序列见表3。

2结果与分析

2.1基因组DNA电泳检测

由图1可知，梨属样品基因组DNA电泳检测

结果良好，条带清晰明亮。核酸蛋白分析仪检测结果显示，A260/A280值皆在1.80至2.00之间，说明该梨属样品基因组DNA提取纯度和浓度都较高，符合PCR试验的要求。

2.2SRAP-PCR反应体系优化结果

试验中正交体系的PCR产物电泳结果见图2。通过新复极差法[10]对图2中的16个组合（各2次重复）的扩增结果进行分析，最终得到各因素不同浓度水平的总分值、平均分值和极差值，极差分析结果见表4。

2.2.1Mg2+浓度优化分析Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。适宜浓度一般在0.5～2.5 mmol/L之间。本试验中，Mg2+浓度为1.5 mmol/L时，平均分值最低为8.75分；为2.0 mmol/L时，平均分值最高为12.25分。说明梨属SRAP-PCR反应中Mg2+的适宜浓度为2.0 mmol/L。

2.2.2dNTPs浓度优化分析由表4可以看出，dNTPs浓度为100 μmol/L时，反应产量低，平均分值也低至7.50分；浓度为200 μmol/L时，平均分值达最高值12.25分。说明梨属SRAP-PCR反应的适宜dNTPs浓度为200 μmol/L。

2.2.3引物浓度优化分析引物浓度为0.1 μmol/L时，产量及平均分值都最低，为8.25分；随引物浓度增加至0.4 μmol/L时，平均分值达最高12.75分。说明梨属SRAP-PCR反应的引物适宜浓度为0.4 μmol/L。

2.2.4Taq DNA聚合酶浓度优化分析Taq DNA聚合酶为2.0 U时，平均分值最低，7.50分；为1.5 U时，平均分值最高，11.75；说明1.5 U Taq DNA聚合酶浓度为梨属SRAP-PCR反应的适宜浓度。

2.2.5模板用量优化分析模板DNA用量为80 ng时，平均分值最低为8.60分，可能影响PCR反应的特异性；当模板DNA用量下降到60 ng时，平均得分增至最高值12.50分。说明梨属SRAP-PCR反应的模板适宜用量为60 ng。

综上分析后得到的最佳反应组合为Mg2+浓度为2.0 mmol/L，dNTPs浓度为200 μmol/L，引物浓度为0.4 μmol/L，Taq聚合酶为1.5 U，模板DNA用量为60 ng。此组合即为体系中第10个处理，由图2可知，该组合扩增结果清晰，条带明亮、无重叠，适于进行SRAP-PCR试验。

参照刘萌芽等[11]的方法，分析了本试验中各因素对SRAP-PCR反应的影响程度。由表4可知，dNTPs浓度的极差值最大，平均分高达4.75，表明dNTPs对梨属SRAP-PCR反应的影响最为显著；次之为引物浓度；影响程度居中的因素为Taq DNA聚合酶；Mg2+浓度和模板DNA的影响程度最小。

2.3最优体系的稳定性检测

采用优化筛选后的SRAP-PCR反应体系结合随机抽取的6对引物组合（Me1/Em16， Me1/Em18， Me2/Em10， Me5/Em10， Me6/Em10， Me6/Em13）对褐梨、杜梨、河北梨、崂山梨 4个野生种进行扩增，结果显示，除第四对引物外，4个梨品种基因组均能扩增出数量不等的条带（图3），表明该最优体系可满足相关试验的要求，有望为进一步的研究提供基础。

3结论与讨论

目前在梨属SRAP的相关研究中，张妤艳等[12]对其影响因素进行过筛选，但缺乏对模板DNA浓度的分析；仅董星光等[1]利用正交优化试验研究过梨SRAP-PCR反应的最适体系。由于PCR扩增的各种不确定性，体系中任何一项细微差异都可能直接影响试验结果，所以随着野生种质资源关注度的提高，有必要对梨属野生种质资源SRAP-PCR体系再优化，以确保资源开发研究的顺利进行。

本研究采用正交直观分析法和新复极差法对梨属野生种质资源SRAP-PCR反应体系进行了优化。最终得出反应的最优组合为：25 μL的总反应体系中含10×PCR Buffer 2.5 μL，Mg2+ 2.0 mmol/L，dNTPs 200 μmol/L，引物 0.4 μmol/L，Taq 酶1.5 U，模板DNA 60 ng。利用该体系结合随机抽取的6对引物组合对4份野生梨属材料进行稳定性验证，扩增结果稳定。因此本研究获得的梨属野生种质资源SRAP-PCR优化体系，可以为今后梨属野生资源的进一步研究提供一定的应用基础。

参考文献：

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