梨属野生种质资源SRAP—PCR反应体系优化研究

2015-03-10 10:49梁婷婷马燕臧德奎
山东农业科学 2014年12期

梁婷婷 马燕 臧德奎

摘要:采用正交直观分析法和新复极差法对影响梨属野生种质资源SRAP-PCR反应的5种因素(Mg2+浓度、dNTPs浓度、引物浓度、Taq DNA聚合酶、模板DNA)4个水平进行优化筛选。结果表明,优化后的梨属SRAP-PCR反应体系为25 μL,包括10×PCR buffer 2.5 μL,2.0 mmol/L Mg2+,200 μmol/L dNTPs,0.4 μmol/L引物,1.5 U Taq酶,60 ng模板DNA。

关键词:梨属;SRAP-PCR;正交直观分析法;新复极差法

中图分类号:S661.201文献标识号:A文章编号:1001-4942(2014)12-0007-04

目前相关序列扩增多态性(Sequence-related amplified polymorphism, SRAP)技术已在多种果树、蔬菜以及大田作物中得以使用,并以其多态性丰富、简单、易测序[1]等优点应用于遗传多样性分析[2]、遗传图谱构建[3]、亲缘关系分析、种质资源鉴定以及比较基因组学等诸多研究领域。

正交PCR试验是基于统计学原理,研究各影响因素不同水平间交互作用的一种方法[4],具有均衡分散和整齐可比的特点,可以简便、快速地找到反应体系的最佳组合[5]。正交直观分析法正是基于PCR正交设计试验的一种结果判断方法,即根据扩增条带的明亮度、特异性及数量的多少进行不同的分数判断,分数越高则表明扩增效果越好。新复极差法(SSR)是方差分析的进一步分析,用于多种因素对某一结果影响的各个因素之间的显著性分析。

目前基于正交设计法的SRAP-PCR技术已在辣椒、石榴等物种的相关研究中得以应用[6,7]。本试验采用正交设计法对梨属野生种质资源SRAP-PCR反应体系进行优化,并通过正交直观分析法和新复极差法,更直观快速地找到梨属SRAP-PCR反应体系的最佳组合,以期为梨属野生种质资源的开发利用与保护提供基础技术支持。

1材料与方法

1.1试验材料

供试材料为秋子梨(Pyrus ussuriensis)、褐梨(Pyrus phaeocarpa)、河北梨(Pyrus hopeiensis)、杜梨(Pyrus betulaefolia)、崂山梨(Pyrus trilocularis)。4月中旬于山东崂山、蒙山等地采集用于提取DNA的幼叶样品,幼叶采集后硅胶干燥保存。

1.2试验方法

1.2.1试剂和仪器DNA扩增采用Bio-Rad PCR仪,扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后在北京六一WD-9403CS型紫外仪上采集图像。试验所用引物由TaKaRa合成;用于PCR反应的Taq DNA聚合酶、Mg2+、dNTPs和Buffer均购自TaKaRa公司。

1.2.2样品基因组DNA的提取梨属样品基因组DNA的提取采用改良的CTAB法[8]。基因组DNA质量的检测采用琼脂糖凝胶电泳法和核酸蛋白分析仪。

1.2.3PCR反应体系的正交试验试验采用L16(45)正交表设计,对影响扩增结果的5因素进行4水平共16个组合的筛选,各体系模板均为秋子梨样品,所选引物为随机Me5/Em11(序列见表3)组合,PCR反应体系总体积设为25 μL,每组合按其浓度计算加样量,并包含10×PCR buffer 2.5 μL,不足部分用超纯水补足。试验各因素水平见表1,正交试验设计见表2。

PCR反应扩增程序:94℃预变性5 min;94℃变性1 min,35℃退火1 min,72℃延伸1 min,循环5次;94℃变性1 min,50℃退火1 min,72℃延伸1 min,循环30次;72℃延伸7 min,4℃保存。扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳分离,20 μL上样,电压120 V电泳90 min,电泳缓冲液为1×TAE,经溴化乙锭(EB)染色后,在紫外仪上采集图像。

PCR扩增结果分析参照何正文等[9]的直观分析法,即对各组合扩增出来的条带分别进行分数判定,分数等级设为3、2、1、0分。判定评分后再参照王军[7]、刘萌芽[11]等的方法,运用新复极差法对试验数据进行分析。

1.2.4体系稳定性检测随机选用6对引物组合对褐梨、杜梨、河北梨、崂山梨 4个野生种进行PCR扩增,经电泳观察结果。所用引物序列见表3。

2结果与分析

2.1基因组DNA电泳检测

由图1可知,梨属样品基因组DNA电泳检测

结果良好,条带清晰明亮。核酸蛋白分析仪检测结果显示,A260/A280值皆在1.80至2.00之间,说明该梨属样品基因组DNA提取纯度和浓度都较高,符合PCR试验的要求。

2.2SRAP-PCR反应体系优化结果

试验中正交体系的PCR产物电泳结果见图2。通过新复极差法[10]对图2中的16个组合(各2次重复)的扩增结果进行分析,最终得到各因素不同浓度水平的总分值、平均分值和极差值,极差分析结果见表4。

2.2.1Mg2+浓度优化分析Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。适宜浓度一般在0.5~2.5 mmol/L之间。本试验中,Mg2+浓度为1.5 mmol/L时,平均分值最低为8.75分;为2.0 mmol/L时,平均分值最高为12.25分。说明梨属SRAP-PCR反应中Mg2+的适宜浓度为2.0 mmol/L。

2.2.2dNTPs浓度优化分析由表4可以看出,dNTPs浓度为100 μmol/L时,反应产量低,平均分值也低至7.50分;浓度为200 μmol/L时,平均分值达最高值12.25分。说明梨属SRAP-PCR反应的适宜dNTPs浓度为200 μmol/L。

2.2.3引物浓度优化分析引物浓度为0.1 μmol/L时,产量及平均分值都最低,为8.25分;随引物浓度增加至0.4 μmol/L时,平均分值达最高12.75分。说明梨属SRAP-PCR反应的引物适宜浓度为0.4 μmol/L。

2.2.4Taq DNA聚合酶浓度优化分析Taq DNA聚合酶为2.0 U时,平均分值最低,7.50分;为1.5 U时,平均分值最高,11.75;说明1.5 U Taq DNA聚合酶浓度为梨属SRAP-PCR反应的适宜浓度。

2.2.5模板用量优化分析模板DNA用量为80 ng时,平均分值最低为8.60分,可能影响PCR反应的特异性;当模板DNA用量下降到60 ng时,平均得分增至最高值12.50分。说明梨属SRAP-PCR反应的模板适宜用量为60 ng。

综上分析后得到的最佳反应组合为Mg2+浓度为2.0 mmol/L,dNTPs浓度为200 μmol/L,引物浓度为0.4 μmol/L,Taq聚合酶为1.5 U,模板DNA用量为60 ng。此组合即为体系中第10个处理,由图2可知,该组合扩增结果清晰,条带明亮、无重叠,适于进行SRAP-PCR试验。

参照刘萌芽等[11]的方法,分析了本试验中各因素对SRAP-PCR反应的影响程度。由表4可知,dNTPs浓度的极差值最大,平均分高达4.75,表明dNTPs对梨属SRAP-PCR反应的影响最为显著;次之为引物浓度;影响程度居中的因素为Taq DNA聚合酶;Mg2+浓度和模板DNA的影响程度最小。

2.3最优体系的稳定性检测

采用优化筛选后的SRAP-PCR反应体系结合随机抽取的6对引物组合(Me1/Em16, Me1/Em18, Me2/Em10, Me5/Em10, Me6/Em10, Me6/Em13)对褐梨、杜梨、河北梨、崂山梨 4个野生种进行扩增,结果显示,除第四对引物外,4个梨品种基因组均能扩增出数量不等的条带(图3),表明该最优体系可满足相关试验的要求,有望为进一步的研究提供基础。

3结论与讨论

目前在梨属SRAP的相关研究中,张妤艳等[12]对其影响因素进行过筛选,但缺乏对模板DNA浓度的分析;仅董星光等[1]利用正交优化试验研究过梨SRAP-PCR反应的最适体系。由于PCR扩增的各种不确定性,体系中任何一项细微差异都可能直接影响试验结果,所以随着野生种质资源关注度的提高,有必要对梨属野生种质资源SRAP-PCR体系再优化,以确保资源开发研究的顺利进行。

本研究采用正交直观分析法和新复极差法对梨属野生种质资源SRAP-PCR反应体系进行了优化。最终得出反应的最优组合为:25 μL的总反应体系中含10×PCR Buffer 2.5 μL,Mg2+ 2.0 mmol/L,dNTPs 200 μmol/L,引物 0.4 μmol/L,Taq 酶1.5 U,模板DNA 60 ng。利用该体系结合随机抽取的6对引物组合对4份野生梨属材料进行稳定性验证,扩增结果稳定。因此本研究获得的梨属野生种质资源SRAP-PCR优化体系,可以为今后梨属野生资源的进一步研究提供一定的应用基础。

参考文献:

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[12]张妤艳, 吴俊, 张绍铃. 梨SRAP-PCR反应体系的建立与优化[J]. 农业生物科技学报, 2007, 15(5):909-910.