MMP-2、MMP-7和MMP-14在胃癌患者组织中表达的临床意义

王一波, 汤黎明

(1. 南京医科大学附属常州市第二人民院 普外科, 江苏 常州, 213000;

2. 江苏大学附属武进医院 普外科, 江苏 常州, 213002)

MMP-2、MMP-7和MMP-14在胃癌患者组织中表达的临床意义

王一波1,2, 汤黎明1

(1. 南京医科大学附属常州市第二人民院 普外科, 江苏 常州, 213000;

2. 江苏大学附属武进医院 普外科, 江苏 常州, 213002)

摘要:目的探讨胃癌组织中MMP-2、MMP-7和MMP-14的表达及临床意义。方法应用链霉素抗生物素蛋白-过氧化酶免疫组化染色法(S-P)法检测98例胃癌组织中MMP-2、MMP-7和MMP-14蛋白的表达。对照组20例为良性胃病变黏膜组织。结果胃癌组中MMP-2、MMP-7和MMP-14表达的阳性率明显高于对照组(P<0.05); 胃癌组中MMP-2及MMP-14的阳性表达率与胃癌的肿瘤浸润深度、淋巴转移、肿瘤大小、大体分型、临床肿瘤分期有关(P<0.05或P<0.01)。MMP-7的阳性表达率与胃癌的肿瘤浸润深度、淋巴转移、分化程度、大体分型、临床肿瘤分期有关(P<0.05或P<0.01)。MMP-2和MMP-7蛋白表达正相关性(r=0.271,P<0.01); MMP-2和MMP-14蛋白表达正相关性(r=0.268,P=<0.01); MMP-7和MMP-14蛋白表达正相关性(r=0.202,P<0.05)。结论MMP-2、MMP-7、MMP-14的表达上调与胃癌的浸润和转移有关。

关键词:胃癌; 基质金属蛋白酶-2; 基质金属蛋白酶-7; 基质金属蛋白酶-14

在中国, 胃癌是消化道常见恶性肿瘤之一，其死亡率居高不下，多数患者就诊时已属浆膜侵犯的进展期。胃癌的浸润和转移在本质上是一个由多步骤、多环节构成的复杂事件。研究表明,癌细胞可产生大量溶解酶降解基质或基底膜，这些溶解酶与癌侵袭转移能力显著相关,溶解酶系统由一庞大的蛋白溶解酶家族构成,被称为基质金属蛋白酶。本文采用链霉素抗生物素蛋白-过氧化酶免疫组化染色法(S-P)法检测98例胃癌组织中基质金属蛋白酶-2(MMP-2)、基质金属蛋白酶-7(MMP-7)和基质金属蛋白酶-14(MMP-14)蛋白的表达，探讨其在胃癌发生发展中的临床意义。

1材料与方法

1.1　一般资料

经本院伦理学会批准，选择临床及病理资料完整的江苏大学附属武进医院普外科2008年1月—2009年12月手术切除并经病理证实为胃癌患者98例。所有患者术前均未进行化疗、放疗或生物治疗,术前及术后病理学检查均诊断为胃癌。其中男60例，女38例；年龄23～82岁，年龄≥60岁46例，<60岁52例，平均(61.3±12.5)岁；肿瘤的原发灶大小、浸润深度、淋巴结转移均由病理观察确定，远处转移由病理学和临床联合确定。根据1990年世界卫生组织(WHO)肿瘤分化程度判断标准将胃癌患者分为高、中、低分化组,其中高分化组8例，中分化组50例，低分化组40例。胃癌分期采用2002年国际抗癌联盟制定的TNM分期标准,其中Ⅰ/Ⅱ期患者36例, Ⅲ/Ⅳ期患者62例。Borrmann分型为Ⅰ/Ⅱ型者54例, Ⅲ/Ⅳ型者44例。肿瘤直径≥5 cm者33例，<5 cm者65例。淋巴结转移阳性者71例,淋巴结转移阴性者巧27例。肿瘤浸润深度局限在浆膜层及浆膜内者66例,累及浆膜层外者32例。腹腔内转移转移者28例,无转移者70例。胃癌免疫组织化学法对照组例数为20例，为良性胃病变黏膜组织。

1.2　实验方法

① 制片。将蜡块制成4 μm厚的切片，贴于涂有多聚赖氨酸的载玻片上，于60 ℃的烤箱内烤片72 h以上; ② 染色。常规HE染色，确定标本的组织分化程度。具体操作步骤如下：二甲苯I、II浸泡各15 min脱蜡；100%酒精浸泡5 min; 95%、85%、75%梯度酒精冲洗水化；苏木素染色6 min; 盐酸酒精分化2～3 s; 温水浸泡返蓝10 min; 伊红染色6 min; 75%、85%、95%梯度酒精冲洗；100%酒精Ⅰ、Ⅱ浸泡各5 min; 二甲苯Ⅰ、Ⅱ浸泡各5 min; 中性树胶封片。以上操作均在室温下进行，进行前用水充分冲洗; ③ 采用链霉素抗生物素蛋白-过氧化酶免疫组化染色法(S-P法)。具体操作步骤如下: ① 烤片, 68 ℃, 20 min; ② 常规二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水；二甲苯Ⅰ 20 min -二甲苯Ⅱ 20 min-100%酒精Ⅰ10 min -100%Ⅱ 10 min -95% 5 min-80% 5 min-70% 5 min; ③ 阻断。灭活内源性过氧化物酶: 3% H2O237 ℃孵育10 min，PBS冲洗3×5 min; ④ 抗原修复:置0.01 M枸橼酸缓冲液(pH 6.0)中用煮沸(95 ℃, 15～20 min)，自然冷却20 min 以上，再用冷水冲，加快冷却至室温，PBS冲洗3×5 min; ⑤ 正常羊血清工作液封闭, 37 ℃10 min, 倾去勿洗; ⑥ 滴加一抗4 ℃冰箱孵育过夜, PBS冲洗3×5 min(用PBS缓冲液代替一抗作阴性对照)；滴加生物素标记二抗, 37 ℃孵育30 min, PBS冲洗3×5 min; ⑦ 滴加辣根过氧化物酶标记的链霉素卵白素工作液, 37 ℃孵育30 min, PBS冲洗3×5 min; ⑧ DAB/H2O2反应染色，自来水充分冲洗后，苏木素复染，常规脱水，透明，干燥，封片; ⑨ 对照：用已知阳性的切片作为阳性对照，PBS缓冲液代替一抗作阴性对照; ⑩ 工作浓度: MMP-2一抗工作浓度为1∶40, MMP-7一抗工作浓度为1︰25，MMP-14一抗工作浓度为1∶100。

1.3　结果判定

均以细胞浆内或细胞膜上出现黄色或棕黄色颗粒为阳性着色。每例随机观察5个高倍视野,结果采用半定量积分法，首先将染色强度打分:0分为无色，1分为淡黄色，2分为棕黄色，3分为棕褐色 (染色深浅需与背景着色相对比)。再将阳性细胞所占的百分比打分: 0分为阴性, 1分为阳性细胞簇10%, 2分为11%～50%, 3分为51%～75%, 4分为>75%。染色强度与阳性细胞百分比的乘积≥3分为阳性,<3分为阴性，以上评分由两位不知具体临床资料的病理专家单独进行评分。用PBS代替一抗作阴性对照，已知阳性切片作为阳性对照。

1.4　统计学方法

采用SPSS 13.0软件进行统计学处理, MMP-2,MMP-7及MMP-14表达强度在不同病理分级和TNM分期的比较采用单因素方差分析，采用χ2检验或者运用Fisher精确概率法进行统计；组间相关性采用Pearson相关分析；以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1　MMP-2、MMP-7和MMP-14在2组中表达阳性率的比较

MMP-2在胃癌组织中的阳性表达率为77.6%(76/98)，明显高于在非肿瘤胃黏膜组织中的10%(2/20); MMP-7在胃癌组织中的阳性表达率为69.4%(68/98)，明显高于在非肿瘤胃黏膜组织中的0%(0/20); MMP-14在胃癌组织中的阳性表达率为76.5%(75/98)，明显高于在非肿瘤胃黏膜组织中的5%(1/20)，差异有统计学意义(P<0.01)。见图1及表1。

表1　MMP-2、MMP-7 和MMP-14在2组中

与对照组比较，**P<0.01。

A.MMP-2;B.MMP-7;C.MMP-14图1 MMP-2、MMP-7、MMP-14在胃癌组织中阳性表达 (SP法 200倍)

2.2　胃癌组织中MMP-2、MMP-7蛋白和MMP-14蛋白的表达与胃癌临床病理特征的关系

胃癌患者中MMP-2阳性率为77.6%, MMP-14为76.5%, 二者在胃癌组织中的阳性表达率与患者的性别、年龄、分化程度无相关性(P>0.05), 而二者的阳性表达率与胃癌的肿瘤浸润深度、淋巴转移、肿瘤大小、大体分型、临床肿瘤分期有关(P<0.05或P<0.01)。MMP-7表达阳性，阳性率为69.4%, 在胃癌组织中的阳性表达率与患者的性别、年龄、肿瘤大小无相关性(P>0.05), 而MMP-7的阳性表达率与胃癌的肿瘤浸润深度、淋巴转移、分化程度、大体分型、临床肿瘤分期有关(P<0.05或P<0.01)。见表2。

2.3　胃癌组中MMP-2、MMP-7和MMP-14表达的相关性分析

98例胃癌组织中三种蛋白的相关性分析结果显示，MMP-2和MMP-7蛋白表达正相关性(r=0.271,P<0.01); MMP-2和MMP-14蛋白表达正相关性(r=0.268,P<0.01); MMP-7和MMP-14蛋白表达正相关性(r=0.202,P<0.05)。

3讨论

基质金属蛋白酶类(MMPs)是一种重要的蛋白水解酶家族，研究[1]表明其参与了多种肿瘤如肺癌、胰腺癌、肝癌等浸润与转移，机制是降解细胞外基质，同时具有促进新生血管生成、调节细胞间黏附、信号传导等来促进肿瘤的侵袭和转移,目前已知多种MMPs与胃癌密切相关。本文所研究的MMP-2、MMP-7、MMP-14是基质金属蛋白酶家族的重要成员, MMP-2属于胞质型基质金属蛋白酶，又称Ⅳ型胶原酶(胶原酶A)，其作用底物主要是Ⅳ型胶原和明胶; MMP-7属于基质溶解素类，通过降解弹性蛋白、层黏蛋白、Ⅳ型胶原等细胞外基质和基底膜成分；它可以活化MMP-2和MMP-9。MMP-14属于膜型基质金属蛋白酶，可直接降解Ⅰ、Ⅱ型以及明胶等胶原蛋白，还可以激活多种基质金属蛋白酶包括MMP-2和MMP-13[2-3]。

本研究发现，在胃癌组MMP-2蛋白主要定位于细胞质和细胞膜，对照组绝大多数未见表达，极少数呈散在性弱表达。98例男性胃癌患者中76例MMP-2表达阳性(77.6%), 在胃癌组织中的阳性表达率与患者的性别、年龄、分化程度无相关性(P>0.05), 而MMP-2的阳性表达率与胃癌的肿瘤浸润深度、淋巴转移、肿瘤大小、大体分型、临床肿瘤分期有关(P<0.05或P<0.01)。Zheng等[4]发现，在胃癌中,MMP-2的表达与胃癌的浸润深度、淋巴管和血管浸润及淋巴结转移的程度呈明显的正相关。本研究结果也证实了MMP-2与胃癌的浸润深度、淋巴管浸润、区域淋巴结转移及TNM分期有关,并通过对2组淋巴结转移率的差异比较,进一步证明了MMP-2在淋巴结转移中的重要促进作用。也有研究[5]表明，MMP-2的表达和肿瘤细胞的组织学分级以及淋巴结转移显著相关。MMP-7蛋白主要表达于胃癌细胞胞质内，呈棕黄色，多呈散在的片状或灶性分布，而且在肿瘤细胞周围的纤维细胞也可见到棕染颗粒。98例男性胃癌患者中68例MMP-7表达阳性, MMP-7的阳性率为69.4%, 在胃癌组织中的阳性表达率与患者的性别、年龄、肿瘤大小无相关性(P>0.05), 而MMP-7的阳性表达率与胃癌的肿瘤浸润深度、淋巴转移、分化程度、大体分型、临床肿瘤分期有关(P<0.05或P<0.01)。上述研究[6]表明，MMP-7蛋白参与胃癌的进展过程，导致胃癌的浸润和转移，这与有关的研究结果相似。胃癌组MMP-14为细胞质内表达，镜下观察肿瘤细胞胞质出现黄色、棕黄色、棕褐色细小颗粒状，染色明显高于背景为阳性。对照组绝大多数未见表达，极少数呈散在性弱表达。98例男性胃癌患者中，75例MMP-14表达阳性，MMP-14的阳性率为76.5%，在胃癌组织中的阳性表达率与患者的性别、年龄、分化程度无相关性(P>0.05)，而MMP-14的阳性表达率与胃癌的肿瘤浸润深度、肿瘤大小、淋巴转移、大体分型、临床肿瘤分期有关(P<0.05或P<0.01)。

表2　胃癌组MMP-2、MMP-7和MMP-14 的阳性表达在不同临床病理特征中的关系[n(%)]

Yoshikawa等[7]研究证实了在多种肿瘤组织中均有MMP-14蛋白及其mRNA的过度表达，如在肺癌、胃癌、胰腺癌等肿瘤组织中均高表达，且与MMP-2的表达呈正相关，促进肿瘤的发生发展、浸润转移。Shim等[8]研究发现,胃癌与正常胃组织中的MMP-14mRNA的比值与淋巴结转移和肿瘤分期有关。

膜型基质金属蛋白酶MMP-14主要位于肿瘤细胞膜上,能激活前MMP-2,使之转变为活性形式,同时能直接降解细胞外基质,导致肿瘤的浸润和转移，而MMP-2的作用底物是Ⅳ型胶原,它能直接分解基底膜中的纤维连接蛋白和层粘连蛋白,在肿瘤细胞突破基底膜屏障引起浸润转移中起重要作用，这提示MMP-2、MMP-14参与了胃癌的直接浸润和淋巴结转移[9], 本实验也显示MMP-2、MMP-14在胃癌组织中的表达呈正相关,这可能与MMP-14能活化MMP-2有关。其机制可能是MMP-2通过促进MMP-14的表达上调，从而加速降解细胞外基质从而促进胃癌的浸润与转移，促进肿瘤生长、浸润和转移[10]。MMP-7和MMP-14蛋白表达正相关性，表明这两种蛋白在降解细胞外基质方面着一定的协同作用[11-13]。以上结果均提示MMP-2、MMP-7、MMP-14基因与胃癌浸润转移的生物学行为相关,能反映胃癌的浸润、转移潜能，可作为新的肿瘤生物学标志物,为胃癌患者的预后判断提供帮助[14-16]。

综上所述, MMP-2、MMP-7及MMP-14可以促进胃癌的侵袭和转移。三者高表达均与胃癌的浸润深度、区域淋巴结转移、TNM分期、淋巴管浸润及较高淋巴结转移率有关，可作为胃癌恶性程度的预测因子[17-19]。利用免疫组化检测胃癌中MMP-2、MMP-7、MMP-14的表达来判断肿瘤的恶性程度及预后,指导手术及术后综合治疗,具有一定的临床意义[20-21]。

参考文献

[1]Striker G E, Praddaude F, Alcazar O, et al. Regulation of angiotensin Ⅱ receptors and extracellular matrix turnover in human retinal pigment epithelium: role of angiotensin Ⅱ[J]. Am J Physiol Cell Physiol, 2008, 295(12): 1633.

[2]Egeblad M, Werb Z. New functions for the matrix metallo-proteinases in cancer progression[J]. Nature Reviews Cancer, 2002, 2(3): 161.

[3]li M, Yamamoto H, Adachi Y, et al. Role of matrix metallo-proteinase-7 (matrilysin) in human cancer invasion，apoptosi, growth and angiogenesis[J]. Exp Biol Med, 2006, 231(1): 20.

[4]Zheng H, Takahashi H, Murai Y, et al. Expressions ofMMP-2, MMP-9 and VEGF are closely linked to growth, invasion, metastasis and angiogenesis of gastric carcinoma[J]. Anticancer Res, 2006, 26(5A): 3579.

[5]Alakus H, Grass G, Hennecken J K, et al. Clinicopathological significance of MMP-2 and its specific inhibitor TIMP-2 in gastric cancer[J]. Histology and Histopathology, 2008, 23(8): 917.

[6]Wang W S, Chen P M, Wang H S, et al. Matrix metalloproteinase-7 increases resistance to Fas-mediated apoptosis and is a poor prognostic factor of patients with colorectal carcinoma[J]. Carcinogenesis, 2006, 27(5): 1113.

[7]Yoshikawa T, Yanoma S, Tsuburaya A, et al. Expression of MMP-7 and MT1-MMP in peritoneal dissemination of gastric cancer[J]. Hepatogastroenterology, 2006, 53(72): 964.

[8]Shim K N, Jung S A, Joo Y H, et al. Clinical significance of tissue levels of matrix metalloproteinases and tissue inhibitorsof metalloproteinases in gastric cancer[J]. J Gastroenterol, 2007, 42(2): 120.

[9]Sato, H, Takino T. Coordinate action of membrane-type matrix metalloproteinase-1(MT1-MMP)and MMP-2 enhances pericellular proteolysis and invasion[J]. Cancer Sci, 2010, 8(101): 843.

[10]Al-Raawi D, Abu-El-Zahab H, El-Shinawi M, et al.Membrane type-1 matrix metalloproteinase (MT1-MMP) correlates with the expression and activation of matrixetalloproteinase-2 ( MMP-2) in inflammatory breast cancer[J]. Int J Clin Exp, 2011, 4(4): 265.

[11]范荣钢, 凌林, 查明, 等. EMMPRIN及MMP-9在胃癌中的表达及其意义[J]. 中华全科医学, 2010, 8(8): 977.

[12]孔梅, 王莺, 林宇静. PRL-3在癌症淋巴结转移中的表达及临床意义[J]. 中华全科医学, 2010, 8(12): 1505.

[13]姚卫洲. 全胃切除术后经留置鼻空肠营养管与空肠造口行肠内营养的效果比较[J]. 海南医学院学报, 2011, 17(6): 780.

[14]李春花, 赵国策, 樊超强, 等. 食管癌晚期合并食管狭窄支架置入术后209例临床护理[J]. 第三军医大学学报, 2013, 35(7): 689.

[15]孙曦, 王向东, 卢忠生, 等. 消化内镜技术用于消化道早癌诊断治疗价值研究[J]. 中国实用内科杂志, 2013, 33(3): 207.

[16]霍蕊, 张珍珍, 焦文芹, 等. 胃癌术后早期使用肠内营养泵的护理观察[J]. 中华全科医学, 2011, 9(4): 646.

[17]李增宁. 肿瘤患者营养支持[J]. 中国实用内科杂志, 2011, 31(3): 188.

[18]王婷婷, 庄园, 陈娜, 等. 肿瘤相关中性粒细胞在胃癌中的分布、表型及其免疫抑制功能研究[J]. 第三军医大学学报, 2014, 36(6): 587.

[19]文峰, 陈兰, 程建国, 等. Ezrin 和CD44在胃癌组织中的表达及临床意义[J]. 实用临床医药杂志, 2014 , 18 (3): 19.

[20]宋桂芹, 刘康, 白亦光, 等. SATB1 在胃癌细胞SGC-7901 中表达的研究[J]. 中华全科医学, 2014 , 12 (1): 21.

[21]刘利敏, 李继坤. E-cadherin、Snail、Twist 在胃癌组织及淋巴结转移灶中的表达及临床意义[J]. 实用临床医药杂志, 2014 , 18 (21): 71.

Expression and clinical significance of

MMP-2, MMP-7 and MMP-14 in the tissue

of patients with gastric cancer

WANG Yibo1,2, TANG Liming1

(1.DeprtmentofGeneralSurgery,ChangzhouSecondPeople′sHospitalAffiliatedto

NanjingMedicalUniversity,Changzhou,Jiangsu, 213002; 2.DeprtmentofGeneral

Surgery,WujinHospitalAffiliatedtoJiangsuUniversity,Changzhou,Jiangsu, 213002)

ABSTRACT:ObjectiveTo investigate the expressions and clinical significance of MMP-2, MMP-7 and MMP-14 in the tissue of patients with gastric cancer. MethodsThe expressions of MMP-2, MMP-7 and MMP-14 were detected by S-P immunohistochemical staining in gastric cancer (n=98) and normal control(n=20). ResultsIn gastric cancer group, the positive expression rate of MMP-2, MMP-7 and MMP-14 were significantly higher than those in normal control group(P<0.05). The positive expression rate of MMP-2 and MMP-14 in gastric cancer were correlated with the depth of invasion, lymph node metastasis, tumor size, macroscopic type, tumor clinical stage (P<0.05,P<0.01). The positive expression rate of MMP-7 in the gastric cancer was correlated with the depth of invasion, lymph node metastasis, differentiation, macroscopic type, tumor clinical stage (P<0.05,P<0.01). The correlation analysis showed that there was positive correlation between expressions of MMP-2 and MMP-7 (r=0.271,P<0.01). There was positive correlation between expression of MMP-2 and MMP-14 (r=0.268,P<0.01). There was positive correlation between expression of MMP-7 and MMP-14 (r=0.202,P<0.05). ConclusionUp-regulation of MMP-2, MMP-7 and MMP-14 were correlated with invasion and metastasis of gastric cancer.

KEYWORDS:gastric cancer; matrix metalloproteinase-2; matrix metalloproteinase-7; matrix metalloproteinase-14

通信作者:汤黎明, E-mail: Drtanglm@gmail.com

基金项目:江苏省卫生厅面上项目(D2010023)

收稿日期:2015-03-10

中图分类号:R 735.2

文献标志码:A

文章编号:1672-2353(2015)15-044-05

DOI:10.7619/jcmp.201515013