HPLC法测定不同生长年限的葛根不同部位中葛根素的含量Δ

刘计权，宋 强，杨文珍，任剑锋，宋晓春（山西中医学院中药学院，太原 030024）

葛根为豆科植物野葛Pueraria lobata（Willd.）的干燥根，味甘、辛、凉，归脾、胃经，具有解肌退热、生津、透疹、升阳止泻、通经活络、解酒毒等功效[1]。葛根的主要有效成分葛根素有多重药理作用。现代药理及临床研究表明，葛根素具有明显的扩张血管作用，临床上广泛应用于治疗缺血性心肌病、脑血栓、视网膜动静脉栓塞[2-3]，以及由糖尿病引起的微循环障碍等[4-8]。葛根有效成分的形成和积累，不仅受其遗传基因、生长环境的影响，同时也与其生长年限、器官与组织部位有着密切关系[9]。本研究采用高效液相色谱（HPLC）法测定了不同生长年限的葛根不同部位中葛根素的含量，以期为葛根药材的规范化栽培和加工利用提供科学依据。

1 材料

1.1 仪器

515型HPLC仪，包括515型输液泵、2996型紫外检测器（美国Waters公司）；EL204型万分之一电子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；KQ3200E型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；HH.S21-6型数显恒温水浴锅（上海申胜生物技术有限公司）。

1.2 试剂

葛根素对照品（中国食品药品检定研究院，批号：110752-200912）；甲醇为色谱纯，乙醇为分析纯，水为纯净水（杭州娃哈哈集团有限公司）。

1.3 药材

葛根药材采自山西省平陆县葛根种植基地，经山西中医学院刘计权副教授鉴定为豆科植物野葛P.lobata（Willd.）的根和茎。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Diakma Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇-水（25 ∶75，V/V）；流速：1.0 ml/min；柱温：室温；检测波长：250 nm。高效液相色谱见图1。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液 精密称取葛根素对照品1.8 mg，置于10 ml量瓶中，加30%乙醇溶解并定容，摇匀，经0.45 μm微孔滤膜滤过后密封，得质量浓度为0.18 mg/ml的对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液 取葛根样品适量，粉碎，过3号筛，精密称取约0.2 g，置于圆底烧瓶中，精密加入30%乙醇50 ml，称定质量，加热回流30 min，放冷，再次精密称定，用30%乙醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液经0.45 μm微孔滤膜滤过，即得。

2.3 线性关系考察

分别精密吸取“2.2.1”项下对照品溶液1、3、5、8、11 μl，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。以葛根素的进样量（x，μg）为横坐标、峰面积（y）为纵坐标，进行线性回归，得回归方程为y＝768 452x－316 936（r＝0.999 8）。结果表明，葛根素的进样量在0.18～1.98 μg范围内与其峰面积积分值呈良好线性关系。

2.4 精密度试验

取葛根素对照品适量，按“2.2.1”项下方法制备对照品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果，葛根素峰面积的RSD为1.88%，表明仪器精密度良好。

2.5 稳定性试验

取同一供试品溶液适量，分别于放置0、2、4、6、8、10 h时，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果，葛根素峰面积的RSD为1.08%，表明供试品溶液在10 h内稳定性良好。

2.6 重复性试验

取同一批葛根样品（一年生葛根韧皮部）约0.2 g，精密称定，按“2.2.2”项下方法平行制备供试品溶液6份，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果，葛根素峰面积的RSD为2.39%，表明本方法重复性良好。

2.7 加样回收率试验

精密称取已知含量的葛根样品（一年生葛根韧皮部）约0.1 g，共6份，分别精密加入葛根素对照品适量，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积，并计算加样回收率，结果见表1。

表1 加样回收率试验结果（n＝6）Tab 1 Results of recovery tests（n＝6）

2.8 样品含量测定

分别取不同的葛根样品粉末适量，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，重复3次，记录峰面积，计算葛根素的质量分数，结果见表2。

由表2可以看出，总体来讲，木质部中葛根素的质量分数＞韧皮部＞茎部，木质部与韧皮部中葛根素的质量分数比较接近，而茎部质量分数显著低于木质部与韧皮部；但二年生葛根韧皮部中葛根素的质量分数高于四、五年生葛根木质部。对于不同生长年限的葛根，木质部中葛根素的质量分数随着生长年限有增长之势；但到第三年时，质量分数达到最大，四到五年生葛根木质部中的质量分数有所下降；韧皮部中葛根素的质量分数与木质部呈现出相似的变化趋势，但韧皮部中葛根素的质量分数从第3年就开始有所下降；葛根茎部中葛根素的质量分数随着生长年限的增长一直呈现增长趋势。

表2 样品含量测定结果（n＝3）Tab 2 Results of content determination of samples（n＝3）

3 讨论

笔者在进行样品提取时发现，葛根韧皮部提取液的颜色较木质部深，但含量测定结果显示木质部中葛根素的平均质量分数高于韧皮部，可见提取液颜色的深浅与质量分数没有必然联系。

在提取过程中考虑到不同浸泡时间可能会导致葛根素在乙醇中的浸出率不同，为此笔者进行了不同浸泡时间（直接提取、浸泡20 min、浸泡40 min）对葛根素质量分数影响的对比研究。结果，葛根素的质量分数分别为2.91%、2.93%和2.94%，以浸泡40 min后葛根素的质量分数最高，但差异不大。考虑到提取效率，本研究最终确定采用直接提取的方式。

同一生长年限的葛根木质部中葛根素的质量分数高于葛根韧皮部，分析其原因可能是葛根韧皮部外围的木栓层在总质量中占有一定的比例，从而导致韧皮部中葛根素的质量分数偏低。因此，在葛根初加工时，将葛根表面的粗皮（木栓层）刮去，可提高葛根中葛根素的质量分数[10]。

综上所述，该方法操作简单、结果可靠，适用于葛根药材的质量控制。由含量测定结果可知，葛根适宜的采收期应确定在第2～3年；葛根茎部中葛根素的含量较少，不宜入药。

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[S].2010年版.北京：中国医药科技出版社，2010：312.

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[3]刘计权，刘亚明，裴香萍，等.山西产葛根总黄酮及3种异黄酮含量的测定[J].中华中医药杂志，2012，27（2）：309.

[4]杨志勇.葛根醇提物对糖尿病模型大鼠血脂与血管的保护作用[J].中国药房，2013，24（43）：4 063.

[5]唐洪梅，柴玉娜，涂星，等.丹参联合葛根对糖尿病眼病模型大鼠的协同作用[J].中国药房，2014，25（11）：977.

[6]李燕燕，边宝林，杨健，等.葛根丹参胶囊成型工艺的研究[J].中国实验方剂学杂志，2008，14（4）：22.

[7]王金萍，曾明，边佳明，等.葛根复方对创伤应激大鼠神经内分泌的调整作用[J].中国实验方剂学杂志，2007，13（3）：50.

[8]陈丽红，唐于平，王强.葛根芩连配方颗粒提取工艺研究[J].中国实验方剂学杂志，2010，16（14）：4.

[9]郭巧生.药用植物栽培学[M].北京：高等教育出版社，2004：45.

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