HPLC法测定复方玄驹胶囊中淫羊藿苷的含量

杨炳川，杨浩然，方应权，周 勇，龙 明，冉 宏（重庆三峡医药高等专科学校附属医院，重庆 404000）

复方玄驹胶囊由黑蚂蚁、淫羊藿、枸杞子、蛇床子等4种中药组成，具有温肾、壮阳、益精之功效，临床常用于治疗肾阳虚型患者，症见神疲乏力、精神不振、腰膝酸软、少腹阴器发凉、精冷滑泄、肢冷尿频、性欲低下、功能性勃起功能障碍等[1-2]。其中，淫羊藿为方中君药，而淫羊藿苷为淫羊藿的主要活性成分。为进一步控制复方玄驹胶囊的质量，本研究建立了高效液相色谱（HPLC）法测定该药中淫羊藿苷含量的方法。

1 材料

1.1 仪器

1260型HPLC仪，包含二极管阵列检测器（日本岛津公司）；旋转蒸发仪（金坛市华欧实验仪器厂）；减压干燥箱（江苏南京海汪制药机械装备有限公司）；分析天平（上海市天平仪器厂）；超声波清洗器（上海市声波仪器厂）。

1.2 药品与试剂

复方玄驹胶囊（施强药业集团，批号：141001、141002、141003）；淫羊藿苷对照品（中国食品药品检定研究院，批号：110737-200415）；乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Cosmosil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇-0.1%磷酸水溶液（55∶45，V/V）；流速：1.0 ml/min；柱温：30 ℃；检测波长：270 nm；进样量：20 μl。色谱见图1。

图1 高效液相色谱图A.对照品；B.供试品；C.阴性对照；1.淫羊藿苷Fig 1 HPLC chromatogramsA.reference substance；B.test sample；C.negative control；1.icariin

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液 精密取淫羊藿苷对照品8 mg，置于50 ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀；精密吸取2 ml，置于10 ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得质量浓度为32 μg/ml的对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液 精密称取复方玄驹胶囊内容物适量，研细，精密称取0.3 g，置于具塞锥形瓶中，加乙醇适量，称定质量，置水浴上加热回流提取30 min，放冷，再次精密称定，用乙醇补足减失的质量，摇匀，滤过；精密量取续滤液10 ml，蒸干溶剂，残渣加水使溶解，并转移至分液漏斗中，用乙醚振摇提取3次，每次20 ml，弃去乙醚液，水层用醋酸乙酯-水饱和的正丁醇（2∶1，V/V）的混合溶液振摇提取5次；合并提取液，蒸干溶剂，残渣加甲醇使溶解，并转移至50 ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，经0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.3 线性关系考察

取淫羊藿苷对照品适量，加甲醇分别制成每1 ml含淫羊藿苷49.95、99.90、199.80、299.70、399.60、499.50 μg的对照品溶液，分别按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。以对照品的质量浓度（x，mg/ml）为横坐标、峰面积（y）为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程为y＝54 928x+40 162（r＝0.999 7）。结果表明，淫羊藿苷的质量浓度在49.95～499.50 μg/ml范围内与峰面积呈良好线性关系。

2.4 精密度试验

精密量取对照品溶液适量，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果，RSD＝0.06%（n＝6），表明仪器精密度良好。

2.5 稳定性试验

精密吸取对照品溶液适量，分别于配制0、2、4、6、8、12 h时按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果，RSD＝1.6%（n＝6），表明供试品溶液在12 h内稳定性良好。

2.6 重复性试验

取同一批样品约1 g，共6份，精密称定，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积，计算样品含量。结果，RSD＝1.8%（n＝6），表明该方法重复性良好。

2.7 加样回收率试验

精密称取已知含量的同一批样品各适量，共6份，分别精密加入淫羊藿苷对照品溶液各适量，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积，并计算加样回收率，结果见表1。

表1 加样回收率试验结果（n＝6）Tab 1 Results of recovery test（n＝6）

2.8 样品含量测定

取3批次（批号：141001、141002、141003）的样品各1.0 g，精密称定，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积，并计算样品含量。结果，3批样品的含量分别为4.058、5.161、4.350 mg/g，平均含量为4.523 mg/g。

3 讨论

目前，文献报道中关于淫羊藿苷的含量检测方法有紫外分光光度法、导数光谱法、室温燐光法、薄层扫描法、高效液相色谱法、毛细管胶束电动色谱法等[3]，但最为常见的为HPLC法。淫羊藿苷具有可溶解于乙醇、乙酸乙酯的性质。在实验中，笔者曾尝试使用30%、50%、70%的乙醇分别回流提取2次、3次、4次，并进行含量比较。结果显示，70%的乙醇提取效率最高，且醇提3次和4次的淫羊藿苷含量明显较醇提2次高，但醇提3次和4次之间淫羊藿苷含量无明显差异，因此选择70%乙醇回流醇提3次的工艺。

经全波长扫描，淫羊藿苷在270 nm波长处吸收较大，结果与2010版《中国药典》记载一致。因此，确定淫羊藿苷的检测波长为270 nm。在流动相的选择上，有文献报道乙腈-水有拖尾影响[4-5]，笔者尝试使用甲醇-水、甲醇-0.1%冰醋酸、乙腈-3.8%冰醋酸（28∶72，V/V）、甲醇-磷酸水溶液（55∶45，V/V）为流动相进行试验。结果发现，甲醇-磷酸水溶液（55∶45，V/V）出峰良好，且分离度高，阴性样品对测定无干扰，淫羊藿苷的保留时间约为9 min，保留时间、分离度及淫羊藿苷理论板数均符合要求。

综上所述，本研究建立的含量测定方法简单易行、结果准确、重复性好，可用于复方玄驹胶囊的质量控制。

[1]张讯，梁季鸿，梁世坤，等.复方玄驹胶囊联合他莫昔芬治疗特发性少精子症的临床研究[J].中华男科学杂志，2012，18（7）：661.

[2]王欣，苏晶石，杨可为，等.复方玄驹胶囊治疗前列腺炎的疗效观察[J].中华医院感染学杂志，2011，21（10）：2 045.

[3]尹志峰，刘敬闪，张兰桐.淫羊藿苷的含量测定方法[J].中国医院药学杂志，2003，23（8）：47.

[4]崔晓红，袁志芳，张兰桐.益肾强身片中淫羊藿苷的含量测定[J].中国新药杂志，2005，14（11）：78.

[5]凌云.HPLC法测定不同批号复方玄驹胶囊中淫羊藿苷的含量[J].亚太传统医药，2014，10（19）：23.