HPLC法测定岗梅中熊果酸和齐墩果酸的含量

肖彩虹，余以刚，罗苑苑，李 尚（.华南理工大学轻工与食品学院，广州 5064；.广州市黄埔区食品药品检验所，广州 50700；.广东省工伤康复医院，广州 50440）

岗梅为冬青科植物梅叶冬青Ilex asprella的干燥根及茎的炮制加工品，收载于《广东省中药材标准》，其性寒味苦，有清热解毒、生津止渴等功效，临床一般用于治疗感冒发热、肺热咳嗽、咽喉肿痛等证[1-3]。岗梅是我国南方常用中草药，也是不少凉茶的主要原材料[4]。岗梅主要含有三萜及其皂苷类化合物，如乌索酸、熊果酸、齐墩果酸、坡模酸等成分[5-6]。其中，熊果酸和齐墩果酸互为异构体，均为五环三萜酸，两者功效相似，均具有抗炎抗菌、保肝降酶、降血脂、抗氧化、调节免疫和抗癌等多种活性[7-8]。目前，关于岗梅中的熊果酸、齐墩果酸的含量测定尚未见相关文献报道。为此，本研究采用高效液相色谱（HPLC）法测定岗梅中熊果酸和齐墩果酸的含量，以为控制岗梅的药材质量提供参考。

1 材料

1.1 仪器

2695型HPLC仪，配有2996型紫外检测器（美国Waters公司）；xp26型百万分之一电子分析天平（瑞士梅特勒-托利多有限公司）。

1.2 试剂

熊果酸对照品（批号：110742-200516）、齐墩果酸对照品（批号：110709-201206，纯度：94.9%）均购自中国食品药品检定研究院；甲醇、乙腈、冰醋酸为色谱纯，水为纯化水。

1.3 药材

岗梅药材购自广州仁和堂药业连锁药店及广州市大参林连锁药店，经广东省工伤康复医院李尚副主任药师鉴定，均符合《广东省中药材标准》（第一册）标准规定。

2 方法与结果

2.1 混合对照品溶液的制备[9]

精密称取熊果酸对照品10.02 mg、齐墩果酸对照品5.316 mg，置于同一10 ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，得混合对照品贮备液。精密吸取混合对照品贮备液2 ml，置于10 ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，制成每1 ml中分别含熊果酸0.20 mg和齐墩果酸0.10 mg的混合对照品溶液。

2.2 供试品溶液的制备

取药材粉末约3 g，精密称定，置索氏提取器中，加乙醚适量，浸泡过夜，加热回流8 h，提取液挥干乙醚，残渣加甲醇使溶解，转移至5 ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，经0.45µm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.3 色谱条件及系统适用性试验

色谱柱：Thermo-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇-乙腈-0.1%冰醋酸（83∶5∶12，V/V/V）；流速：0.7 ml/min；柱温：30 ℃；检测波长：210 nm；进样量：10 μl。分别取混合对照品溶液、供试品溶液各10 μl，注入HPLC仪，按上述色谱条件进样测定，记录色谱图。理论板数以熊果酸峰计应不低于2 000，熊果酸峰和齐墩果酸峰分离度均＞1.5。色谱见图1。

图1 高效液相色谱图A.混合对照品；B.供试品；1.齐墩果酸；2.熊果酸Fig 1 HPLC chromatogramsA.mixed control；B.test samples；1.oleanic acid；2.ursolic acid

2.4 线性关系考察

精密吸取混合对照品贮备液0.1、0.2、0.5、1.0、2.0 ml，分别置于5 ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，制成熊果酸质量浓度为20.04、40.08、100.2、200.4、400.8 µg/ml，齐墩果酸质量浓度为10.09、20.18、50.45、100.9、201.8 µg/ml的系列混合对照品溶液。精密吸取上述混合对照品溶液各10 μl，分别按“2.3”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。以对照品的进样量（x，µg）为横坐标、峰面积（y）为纵坐标，绘制标准曲线，得熊果酸回归方程为y＝539 369x－55 109（r＝0.999 8，n＝5），齐墩果酸回归方程为y＝545 603x－5 142（r＝0.999 6，n＝5）。结果表明，熊果酸、齐墩果酸的进样量分别在0.200 4～4.008、0.100 9～2.018µg范围内与各自峰面积呈良好线性关系。

2.5 精密度试验

精密吸取混合对照品溶液10µl，按“2.3”项下色谱条件重复进样6次，记录峰面积。结果，熊果酸、齐墩果酸峰面积的RSD分别为1.18%、1.36%（n＝6），表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验

精密吸取同一供试品溶液，在室温下于配制后1、2、4、8、12、24 h按“2.3”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果，熊果酸、齐墩果酸峰面积的RSD分别为1.05%、1.48%（n＝6），表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.7 重复性试验

精密称取同一份样品各适量，共6份，分别按“2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定。结果，熊果酸、齐墩果酸含量的RSD分别为1.23%、1.85%（n＝6），表明本方法重复性良好。

2.8 加样回收率试验

精密称取已知含量的同一批样品各1.5 g，共6份，分别精密加入0.5 ml混合对照品贮备液（含熊果酸和齐墩果酸0.501 0、0.252 2 mg），按“2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.3”项下色谱条件进样测定，计算加样回收率，结果见表1。

2.9 样品含量测定

精密称取不同产地的岗梅各适量，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.3”项下色谱条件进样测定，记录峰面积，并采用外标法计算样品的含量，结果见表2。

表1 加样回收率试验结果（n＝6）Tab 1 Result of recovery tests（n＝6）

表2 样品含量测定结果（%）Tab 2 Result of content determination of samples（%）

3 讨论

3.1 提取方法的考察

笔者曾比较了超声、加热回流后水解、冷浸和索氏提取4种提取方法。结果表明，加热回流后水解和索氏提取测得样品的含量比其他2种方法高出许多，且加热回流后水解和索氏提取的方法两者之间结果差异较小；但采用加热回流后水解测得的样品杂质峰太多、基线不平、操作烦琐，因此最终采用索氏提取的方法。笔者还比较了甲醇、无水乙醇、乙醚、甲醇-盐酸4种提取溶剂对测定结果的影响。结果，以乙醚的提取率最高，故选择乙醚作为提取溶剂。

3.2 流动相的选择

由于熊果酸与齐墩果酸为同分异构体，结构与性质均极其相似，分离测定较为困难。本研究分别采用了甲醇-水、甲醇-水-冰醋酸-三乙胺、甲醇-0.1%磷酸、甲醇-乙腈-0.1%冰醋酸为流动相进行试验，结果以甲醇-乙腈-0.1%冰醋酸为流动相时的色谱峰峰形良好、分离效果最佳。在测定中，流速对分离度的影响也比较大：当流速为1 ml/min时，熊果酸与齐墩果酸峰分离度只能达到1.0；而当流速降低到0.7 ml/min时，分离度＞1.5，可达到基线分离。因此，最终选择0.7 ml/min作为流速。

3.3 检测波长的选择

熊果酸甲醇溶液的最大吸收波长为207 nm，而齐墩果酸甲醇溶液的最大吸收波长为206 nm，二者混合液的最大吸收波长为207 nm。但在207 nm波长下用HPLC法进行测定，熊果酸峰和齐墩果酸峰分离度较差；而在210 nm波长处，熊果酸和齐墩果酸分离度＞1.5，基线平稳，可同时检测两者含量，并且具有较高的灵敏度。故最终选择210 nm作为检测波长。

3.4 其他

本研究结果显示，不同产地的岗梅中熊果酸和齐墩果酸含量稍有不同。这可能是由于药材生长环境、采收时间、生产年限等不同，导致结果出现差异；也有可能是本研究所选岗梅样品为根、茎混用，根、茎中各成分所占比例不同也可能导致结果出现差异，具体原因有待以后进一步研究探讨。

综上所述，该方法准确、灵敏，可为岗梅的质量控制提供参考。

[1]广东省食品药品监督管理局.广东省中药材标准：第一册[S].广州：广东科技出版社，2004：111-113.

[2]何蓉蓉，栗原博，宝丽，等.王老吉凉茶对应激小鼠糖代谢机能及体内过氧化状态的影响[J].中成药，2008，30（8）：1 111.

[3]黄锦茶，陈丰连，陈海明，等.HPLC法测定不同产地岗梅药材中坡模酸的含量[J].中药新药与临床药理，2011，22（6）：679.

[4]何文江，赵钟祥，林朝展，等.梅叶冬青根的化学成分研究[J].华西药学杂志，2012，27（1）：51.

[5]朱伟群，晏桂华，李沛波.岗梅水提取物抗炎作用的实验研究[J].广东药学院学报，2007，23（3）：304.

[6]何少璋，张一萍，喻丽元.岗梅对微生物的作用研究[J].现代医院，2008，8（5）：12.

[7]廖清贵.齐墩果酸天然药物的开发[J].四川林业科技，1999，20（4）：68.

[8]Subbaramaish K.Ursolic acid ingibits cyclooxygenase-2 transcroption in human mammary epithelial cells[J].Cancer Res，2000，69（9）：2 399.

[9]郭淑英，冯波.HPLC法同时测定夏枯草中齐墩果酸和熊果酸的含量[J].中国药房，2010，21（27）：2 537.