蕲艾的HPLC指纹图谱研究

卢 化，张义生，黎 强，杨小金，卢金清#（.武汉市中医医院药剂科，武汉 43004；.湖北中医药大学/湖北省药用植物研发中心，武汉 430065）

艾叶为菊科植物艾Artemisia argyi的干燥叶，具有散寒止痛、温经止血的作用[1]。艾叶在全国各地均有分布，其中以湖北蕲春者品质最好，谓之蕲艾，誉为道地药材。蕲艾Artemisia argyi Levl.et Van.var.argyi cv.Qiai为湖北省蕲春四宝之一，属于我国国家地理标志产品，其茎、叶均可入药。《本草纲目》中记载：“近代惟汤阳者谓之北艾，四明者谓之海艾，自成化以来，则以蕲州（蕲春旧称）者为胜，用充方物，天下重之，谓之蕲艾。”现代研究表明，蕲艾具有抗炎、抗过敏、镇痛、抗肝纤维化、抗疲劳、抗肿瘤、增强免疫、抗氧化等多种药理活性[2-8]。有学者利用反相高效液相色谱（RP-HPLC）法同时测定艾叶及其炮制品中棕矢车菊素和异泽兰黄素的含量[9]。但蕲艾的药效成分复杂，仅靠单一指标不能有效控制蕲艾质量。指纹图谱对于中药及其制剂可提供丰富的鉴别信息，能够全面反映中药多组分复杂体系，其宏观、可量化的鉴别手段能综合反映和有效控制中药的质量，已成为国际公认的中药质量评价和质量控制的有效手段。中药指纹图谱法从中药材到中成药的生产过程中，每一步都有明确的控制指标，而指纹图谱就是将这些指标图形化、信息化[10]。目前尚未有关于蕲艾指纹图谱的相关研究。为了从整体上有效地评价和控制其质量，本试验采用HPLC法对蕲艾指纹图谱进行了初步的研究，以期为完善蕲艾的品质评价和质量控制提供科学依据。

1 材料

1.1 仪器

DIONEX-ULTIMATE 3000型HPLC仪（美国戴安公司）；CP225D型电子分析天平（德国赛多利斯公司，精度：0.01 mg）；UP5200H型超声波清洗器（熊猫集团南京电子计量有限公司）。

1.2 试剂

柚皮苷、绿原酸、山柰酚对照品（中国食品药品检定研究院，批号分别为：110722-201111、110753-201314、110861-00405）；乙腈为色谱纯（美国天地公司），其余试剂均为分析纯，水为蒸馏水。

1.3 药材

10批蕲艾均于2011年5月采自湖北省蕲春县，经湖北中医药大学生药学教研室鉴定为菊科植物艾A.argyi的干燥叶。10批蕲艾药材来源见表1。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：ZORBAX Extend-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）-0.2%磷酸水溶液（B），梯度洗脱（梯度洗脱程序见表2）；流速：0.8 ml/min；柱温：30 Ⅺ；检测波长：330 nm。色谱见图1。

表1 10批蕲艾药材来源Tab 1 Origins of 10 batches ofA.argyi

表2 梯度洗脱程序Tab 2 Gradient elution procedures

图1 高效液相色谱图A.供试品；B.柚皮苷对照品；C.山柰酚对照品；D.绿原酸对照品；E.混合对照品溶液；F.阴性对照；1.绿原酸；2.柚皮苷；3.山柰酚Fig 1 HPLC chromatogramsA.test sample ；B.naringin control；C.kaempferol control；D.chlorogenic acid control；E.mixed control；F.negative control；1.chlorogenic acid；2.naringin；3.kaempferol

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液 分别精密称取柚皮苷、绿原酸、山柰酚对照品各适量，分别加甲醇溶解制成质量浓度为1.00、0.12、0.15 mg/ml的柚皮苷、绿原酸、山柰酚对照品溶液，即得。

2.2.2 混合对照品溶液 分别精密称取柚皮苷、绿原酸、山柰酚对照品各适量，混匀，置同一量瓶中，加甲醇溶解制成质量浓度分别为1.29、0.05、0.09 mg/ml的柚皮苷、绿原酸、山柰酚的混合对照品溶液，即得。

2.2.3 供试品溶液 取蕲艾药材样品约3 g，粉碎，精密称定，精密加入80%甲醇溶液100 ml，静置24 h，超声萃取1 h，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇适量使溶解，转移至10 ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，经0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.3 方法学考察

2.3.1 精密度试验 取同一批次蕲艾药材样品适量，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件下连续进样5次，记录色谱图。结果，各共有峰的相对保留时间与相对峰面积的RSD值均＜2%，表明仪器精密度良好。

2.3.2 稳定性试验 取同一批次蕲艾样品适量，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，分别于制备0、2、4、8、16、24 h时按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图。结果，各共有峰的相对保留时间与相对峰面积的RSD值均＜2%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.3.3 重复性试验 取同一批次蕲艾样品适量，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图。结果，各共有峰的相对保留时间与相对峰面积的RSD值均＜2%，表明本方法重复性良好。

2.4 指纹图谱的建立与分析

2.4.1 指纹图谱的测定与特征峰的确定 分别精密吸取10批样品溶液各2 μl，注入色谱仪，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图。结果，共标定12个共有峰作为蕲艾药材的指纹图谱特征峰，并选择6号峰（柚皮苷峰）作为参照峰。蕲艾的指纹图谱见图2；10批次蕲艾样品的HPLC指纹图谱见图3。

图2 蕲艾的指纹图谱3.绿原酸；6.柚皮苷；10.山柰酚Fig 2 fingerprint ofA.argyi3.chlorogenic acid；6.naring in；10.kaemplferol

图3 10批次蕲艾样品的HPLC指纹图谱Fig 3 HPLC fingerprint of 10 batches ofA.argyi samples

2.4.2 相似度评价 将所得的图谱数据导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2004版），经过色谱峰匹配，进行色谱峰差异性评价和整体相似性评价；通过该评价系统得出蕲艾的HPLC指纹图谱共有模式，经过与共有模式比较，10批蕲艾共有峰的相对保留时间以及相对峰面积的差别均较小，详见表3、表4。10批蕲艾药材的相似度均＞0.90，表明所建立的指纹图谱技术指标稳定、重复性好，10批蕲艾药材的主成分基本相同，详见表5。

表3 10批次蕲艾样品指纹图谱各共有峰的相对保留时间Tab 3 Relative retention time of 10 batches ofA.argyi samples fingerprint peaks

表4 10批次蕲艾样品指纹图谱各共有峰的相对峰面积Tab 4 Relative retention area of 10 batches ofA.argyi samples fingerprint peaks

表5 10批次蕲艾样品相似度测定结果Tab 5 Similarity measurement results of 10 batches ofA.argyi samples

3 讨论

3.1 检测波长的选择

分别取柚皮苷、山柰酚、绿原酸对照品溶液及供试品溶液各适量，按“2.1”项下色谱条件进样分析，采用二极管阵列检测器（DAD）在190～400 nm波长范围内进行扫描分析。结果显示，在330 nm处对照品溶液与供试品溶液均有最大吸收，检测灵敏度高，因此最终确定以330 nm为检测波长。

3.2 流动相的选择

本试验前期曾以甲醇-水、乙腈-水作为流动相进行等度和梯度洗脱考察，但色谱峰分离效果较差。在不断尝试色谱条件后，最终选用乙腈-0.2%磷酸水溶液梯度洗脱，在该色谱条件下，色谱图分离效果较为理想。

3.3 提取方法的选择

本试验分别采用加热回流提取法、超声提取法对蕲艾进行制样。结果表明，加热回流提取和超声提取的结果差异不大，但超声提取操作简便、快捷，因此采用超声提取法作为供试品溶液的制备方法。

本研究首次采用HPLC法对蕲艾的指纹图谱进行了初步研究，试验结果表明各批次样品之间相似度较高，样品之间相关性良好，符合中药指纹图谱相似度评价的基本要求。本研究初步建立了蕲艾的HPLC指纹图谱，方法学考察结果表明该方法稳定、可靠、重复性好，可为蕲艾的品质评价和质量控制提供参考依据。

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[S].2010年版.北京：中国医药科技出版社，2010：82.

[2]蒋涵，侯安继，项志学，等.蕲艾挥发油的抗炎、抗过敏和镇痛作用[J].医学新知杂志，2005，15（2）：36.

[3]熊振芳，邢彩珍，胡慧，等.蕲艾提取液对免疫性肝纤维化大鼠Smad3、Smad7表达的影响[J].时珍国医国药，2013，24（3）：627.

[4]费新应，周虹，李华成，等.蕲艾提取液药物血清对大鼠肝星状细胞凋亡的影响[J].中西医结合肝病杂志，2013，23（5）：289.

[5]蒋涵，侯安继，项志学，等.蕲艾挥发油的抗疲劳作用研究[J].武汉大学学报：医学版，2005，26（3）：373.

[6]杨琳，李善俊.MTT法检测蕲艾鞣酸体外抗肿瘤的活性[J].中国民康医学，2013，25（8）：1.

[7]黄菁，陈友香，侯安继，等.蕲艾挥发油对小鼠的免疫调节作用[J].中药药理与临床，2005，21（2）：21.

[8]洪宗国，杨梅，农熠瑛，等.蕲艾燃烧灰烬提取物抗自由基作用[J].中南民族大学学报：自然科学版，2008，27（3）：47.

[9]周倩，孙立立，江波，等.RP-HPLC法同时测定艾叶及其炮制品中棕矢车菊素和异泽兰黄素的含量[J].中国药房，2013，24（47）：4 464.

[10]刘文，蒋世云.中药指纹图谱研究与应用进展[J].中国药房，2011，22（19）：1 819.