RP-HPLC法测定含银杏药妆品中槲皮素的含量Δ

蒋 瑶，褚燕斌，孔 荔，张浩琳，王若晨，童 杰，马 宁（长沙医学院药学院，长沙 410219）

药妆品（Cosmeceutical）是指具有药物性质的化妆品。由药物（Pharmaceutical）和化妆品（Cosmetic）两个词组合而成，又称功能化妆品（Function-cosmetics）、疗效化妆品（Cos-medics）、医学化妆品（Medicined cosmetics）、生理活性化妆品（Physiologically active cosmetics）或美容药等，是集清洁、保养、美化、修饰于一体，具有抑制色素生长、保持皮肤柔润娇嫩、提升皮肤弹性等功效的化妆品。

含银杏的药妆品在国内、外化妆品市场上占有较大份额，深受女士的喜爱。研究表明，槲皮素是银杏提取物的重要有效成分之一，能润泽肌肤、抑制黑色素生长、保持皮肤光泽与弹性、延缓皮肤衰老[1-5]。本研究首次采用高效液相色谱（HPLC）法测定含银杏药妆品中槲皮素的含量，并对市售多种产品进行了检测，以为控制含银杏药妆品的质量提供科学依据。

1 材料

1.1 仪器

LC-600型HPLC仪，包括LC-P600型高压恒流泵和LC-UV600型紫外检测器（南京科捷分析仪器有限公司）；LC-100型液相色谱工作站（上海伍丰科学仪器有限公司）；AL204型电子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；AS3120型超声波清洗器（天津市奥特赛恩斯仪器有限公司）；溶剂过滤器（天津津腾实验设备有限公司）；RE-52C型旋转蒸发仪（巩义市予华仪器有限公司）；超纯水机（上海和泰仪器有限公司）。

1.2 样品与试剂

银杏叶水漾精华（A，网购，批号：P3x2）；银杏柔润凝水柔肤液（B，网购，批号：G08A45）；银杏天然爽肤水（C，网购，批号：VO304）；银杏柔白水分精华液（D，网购，批号：05A73YCB）；银杏果嫩白精华液（E，网购，批号：20140209）；槲皮素对照品（中国食品药品检定研究院，批号：100081-200907，纯度＞98%）；甲醇为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：ODS-2HYPERSIL（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇-0.5%磷酸（50∶50，V/V）；流速：1.0 ml/min；检测波长：360 nm；柱温：30 ℃；进样量：20 μl。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液 精密称取经五氧化二磷减压干燥24 h的槲皮素对照品1.0 mg，置于100 ml棕色量瓶中，加流动相稀释并定容，摇匀，即得质量浓度为10 μg/ml的对照品溶液，避光保存。

2.2.2 供试品溶液 取产品A约9 g，精密称定，置于100 ml圆底烧瓶中，精密加入25 ml甲醇-25%盐酸（4∶1，V/V）的混合溶液，摇匀使溶解，加热回流2 h，放冷；转移至50 ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，置于旋转蒸发仪中旋转蒸干，残渣加流动相使溶解，定容至10 ml量瓶中；取上清液，经0.45 μm微孔滤膜滤过，即得。

2.2.3 阴性样品溶液 取产品A约9 g，精密称定，置于100 ml圆底烧瓶中，精密加入25 ml甲醇-水（4∶1，V/V）的混合溶液，摇匀使溶解，加热回流2 h，放冷；转移至50 ml量瓶中，加甲醇定容，置于旋转蒸发仪中旋转蒸干，残渣加流动相使溶解，定容至10 ml量瓶中；取上清液，经0.45 μm微孔滤膜滤过，即得。

2.3 系统适用性试验

分别吸取“2.2”项下的对照品溶液、供试品溶液和阴性样品溶液各20 μl，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱峰。结果显示，槲皮素与供试品中其他组分的色谱峰可达到基线分离，分离度＞1.5；所测成分理论板数以槲皮素峰计均不低于2 500；阴性样品无干扰。色谱见图1。

图1 高效液相色谱图A.对照品；B.供试品；C.阴性样品；1.槲皮素Fig 1 HPLC chromatogramsA.reference；B.test samples；C.negative samples；1.quercetin

2.4 线性关系考察

精密吸取槲皮素对照品适量，用流动相依次稀释，制成质量浓度分别为0.565、1.130、1.695、2.260、2.825、3.390 μg/ml的对照品溶液，经0.45 μm微孔滤膜滤过，按“2.1”项下色谱条件分别进样20 μl测定，记录峰面积。以对照品的进样量（x，μg）为横坐标、峰面积（y）为纵坐标，绘制标准曲线，得槲皮素的回归方程为y＝62 480x－622.64（r＝0.999 6）。结果表明，槲皮素的进样量在0.011 3～0.067 8 μg范围内与各自峰面积呈良好线性关系。

2.5 检测限与定量限

取质量浓度为50 μg/ml的槲皮素对照品溶液适量，用流动相逐级稀释，摇匀，经0.45 μm微孔滤膜滤过，按“2.1”项下色谱条件进样测定。当信噪比为3∶l时测得槲皮素的检测限为0.058 μg/ml；当信噪比为10∶l时测得槲皮素的定量限为0.149 μg/ml。

2.6 精密度试验

精密吸取质量浓度为1.130 μg/ml的对照品溶液20 μl，按“2.1”项下色谱条件连续进样6次，记录峰面积。结果，RSD＝1.73%（n＝6），表明仪器精密度良好。

2.7 重复性试验

精密称取样品A适量，共6份，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积，计算样品A中槲皮素的含量。结果，样品A中槲皮素的平均含量为1.715 2 μg/g，RSD＝1.36%（n＝6），表明该方法重复性良好。

2.8 稳定性试验

精密吸取同一供试品溶液适量，于室温下放置，分别于配制0、2、4、6、8、10、12、24 h时按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果，RSD＝1.52%（n＝8），表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.9 加样回收率试验

取已知含量的样品A共9份，每份约9 g，精密称定，每3份为一组，分别精密加入高、中、低质量浓度的对照品溶液各适量，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积，并计算加样回收率，结果见表1。

表1 加样回收率试验结果（n＝9）Tab 1 Results of recovery tests（n＝9）

2.10 样品含量测定

分别精密称取5种药妆产品各适量，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积，并采用外标法计算样品含量。结果，仅样品A中槲皮素含量得以检出，其含量为1.715 2 μg/g；其余产品不含槲皮素或槲皮素含量在检测限以下。

3 讨论

3.1 流动相的选择

流动相的选择是HPLC法分离的关键环节，根据有关槲皮素含量测定的相关文献，笔者考察了甲醇-0.4%磷酸（50∶50，V/V）[6]、甲醇-0.4%磷酸（45∶55，V/V）[7]、甲醇-0.5%磷酸（50∶50，V/V）[8]3种流动相体系对化妆品中槲皮素的洗脱效果。结果显示，前两个流动相使待测成分发生了严重的拖尾现象；而甲醇-0.5%磷酸（50∶50，V/V）可有效改善其色谱行为，色谱峰形对称、尖锐，且所有样品在槲皮素出峰时间段内无其他成分干扰。

3.2 提取方法的选择

槲皮素为黄酮苷元，其水溶性较差，可溶于甲醇、乙酸乙酯、冰醋酸等，而其苷类则较易溶于水[9]。本研究采用甲醇-25%盐酸（4∶1，V/V）的混合液来提取并水解样品中的槲皮素。该方法操作简单，同时所选取样品中的其他成分对槲皮素的测定均无干扰作用。本研究曾考察过先水解后进一步萃取的方法[10]，目的是为了减少供试品溶液中的杂质，但用此法制备的样品始终未能在槲皮素的相应时间段内出峰。

3.3 水解条件的选择

银杏药妆品的产品成分中包含有银杏叶提取物，而槲皮素是银杏叶提取物中黄酮类化合物的主要成分之一[11]，因此在分析测定槲皮素含量时，一般先要通过在酸性条件下水解，使黄酮苷转化成槲皮素等黄酮苷元。笔者曾考察甲醇-1.5 mol/L盐酸（1∶1，V/V）[12]、甲醇-25%盐酸（4∶1，V/V）[13]两种溶液对样品的水解效果。结果显示，在水解时间相同的情况下，后者水解测得的槲皮素含量更高，因此最终确定采用甲醇-25%盐酸（4∶1，V/V）的混合溶液对产品进行水解。又参考邓丹丹等[14]的研究，最终确定样品的水解时间为2 h。

3.4 方法适用性考察

试验所选的药妆品均呈液体，产品的成分、性质相似。对未检测出槲皮素的样品（即样品B、C、D、E）进行加样回收试验，结果平均回收率分别为99.31%、101.28%、98.41%、99.49%。结果表明，该提取方法适用于测定所选的含银杏药妆品中槲皮素的含量。

3.5 阴性样品的制备方法

银杏叶提取物中的黄酮类化合物未经酸水解一般不能得到槲皮素，因此在含量测定时，槲皮素在相应时间段内不会出峰。因此，本研究阴性样品的制备为将“2.2.2”项下供试品溶液制备过程中的甲醇-25%盐酸（4∶1，V/V）混合溶液改为甲醇-水（4∶1，V/V）混合溶液，其余试验条件不变，依法操作即得。

综上，本研究选择当前市场上热销的5种知名药妆品作为研究对象，建立了HPLC法以测定其中主要有效成分槲皮素的含量。结果表明，只有样品A中可检测出槲皮素，而其余4种药妆品中均未检出，说明这些药妆品中可能不含槲皮素或者槲皮素的含量低于检测限。槲皮素作为银杏药妆品中的重要活性成分，若其含量未能得到有效控制，无疑损害了消费者的利益，所以增加银杏药妆品中槲皮素含量的控制标准以保证其质量，是非常必要的。因此，笔者呼吁相关部门有必要制订药妆品的质量标准，进一步规范药妆品市场，保护消费者的权益。

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