京大戟中大戟二烯醇对照品的制备研究Δ

葛秀允，孙立立，张乐林（山东省中医药研究院/国家中医药管理局中药蜜制和制炭炮制技术与原理重点研究室，济南 250014）

京大戟系大戟科植物大戟Euphorbia pekinensisRupr.的干燥根，是临床常用的有毒中药，具有泻水逐饮、消肿散结的作用。为了分析京大戟的活性成分，本课题组对京大戟化学成分和毒性药效作用进行了系统的研究。有研究发现，京大戟中三萜类成分是其利尿作用的药效物质基础[1]。其中，大戟二烯醇的含量较大，质量分数约占1%。2010 年版《中国药典》（一部）京大戟药材质量标准只收载了显微、化学法鉴别等方法。为此，本试验以京大戟为原料，采用硅胶柱色谱、凝胶色谱、重结晶等分离方法制备大戟二烯醇化学对照品并进行标准物质研究，以期为京大戟药材和含京大戟的成方制剂的质量控制及药效物质基础研究奠定基础。

1 材料

XT-4 型双目显微熔点测定仪（北京泰克仪器有限公司）；500 MHz核磁共振波谱仪（瑞士Bruker 公司，以四甲基硅烷为内标）；2020 型液质联用仪，包括LC-20 AD 高压二元泵、SPD-M20A 型二级管阵列检测器、SIL-20 AC 型自动进样器、CTO-20 AC 型柱温箱、LC-MS 2020 型单级四极杆质谱、LC-Solution 工作站（日本岛津公司）；1100 型高效液相色谱（HPLC）仪，包括G1361型高压二元泵、G1365 B型多波长检测器（美国Agilent公司）。

大戟二烯醇对照品（中国食品药品检定研究院，批号：111866-201001，纯度：98.6%）；石油醚、乙酸乙酯、正丁醇（天津市富宇精细化工有限公司，分析纯，批号分别为20140304、20140226、20140423），乙腈（天津市德恩化学试剂有限公司，色谱纯，批号：20140217），水为超纯水。色谱柱及薄层色谱（TLC）用硅胶（青岛海洋化工厂）；聚酰胺板（浙江黄岩化工厂）；C18薄层色谱板及色谱柱用C18（40～63 μm）（德国Merck 公司）。

京大戟药材采自山东省淄博市，经山东省中医药研究院林慧彬研究员鉴定为大戟科植物大戟E.pekinensisRupr.的干燥根。

2 方法与结果

2.1 原料处理

取京大戟药材10 kg，粉碎成粗粉，加入10 倍量的95%乙醇，浸泡0.5 h，水浴回流提取1.5 h；后加入10 倍量的95%乙醇，浸泡0.5 h，水浴回流提取1 h；后再加入10 倍量的95%乙醇，浸泡0.5 h，水浴回流提取0.5 h；合并醇提液，减压浓缩至浸膏状，加水溶解，分别用石油醚、乙酸乙酯及正丁醇萃取；取石油醚部位浓缩成浸膏（260 g），加硅胶拌样，上样于硅胶柱（200～300 目），以石油醚-乙酸乙酯（95∶5～70∶30，V/V）梯度洗脱；取洗脱流份（9∶1，V/V），用TLC法进行鉴别。以石油醚-乙酸乙酯（9∶1，V/V）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以硫酸乙醇溶液显色，105 ℃加热5 min，结果显示，京大戟药材中含大戟二烯醇成分。合并大戟二烯醇富集流份，减压回收至干，得大戟二烯醇粗品（560 mg，纯度约78%）。

2.2 对照品的纯化

取大戟二烯醇粗品适量，加甲醇溶解，常温条件下反复重结晶，得到无色针状晶体，减压回收至干后置于恒温干燥箱（60 ℃）干燥24 h，得到无色针状晶体（120 mg）。

2.3 样品的检测

2.3.1 TLC鉴别 取“2.2”项下（共2批）大戟二烯醇自制品10 mg，加入甲醇5 ml，制成质量浓度为2 mg/ml的溶液，作为供试品溶液。另取大戟二烯醇对照品（批号：111866-201001）适量，加甲醇制成每1 ml含2 mg大戟二烯醇的溶液，作为对照品溶液。吸取上述溶液各5 μl，分别点于同一硅胶G 薄层色谱板上，以石油醚-乙酸乙酯（9∶1，V/V）为展开剂，展开，取出，晾干，以硫酸乙醇溶液为显色剂，105 ℃加热5 min，置于日光下检视。结果，供试品色谱中，与对照品色谱相应位置显相同颜色的斑点，其余杂质无干扰。TLC图见图1。

图1 大戟二烯醇的薄层色谱图1～2.大戟二烯醇自制品；3.大戟二烯醇对照品Fig 1 TLC identification of euphol1-2.self-made products of euphol；3.reference substance of euphol

2.3.2 HPLC-紫外（UV）法检测 取“2.2”项下大戟二烯醇自制品适量，加甲醇制成质量浓度为100 μg/ml的溶液。色谱柱：Benetnach C8（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈-0.2%磷酸（83∶17，V/V）；流速：1.0 ml/min；检测波长：203 nm；柱温：30 ℃；进样量：20 μl。理论板数以大戟二烯醇峰计不得少于4 000。精密称取大戟二烯醇对照品适量，加入甲醇制成质量浓度为0.4 mg/ml的对照品溶液，按上述色谱条件进样测定，记录色谱，详见图2。以峰面积归一化法计算大戟二烯醇质量分数为99.7%，符合中药新药质量标准含量测定用对照品的要求（纯度为98.0%以上）。

图2 大戟二烯醇的高效液相色谱图1.大戟二烯醇Fig 2 HPLC chromatograms of euphol1.euphol

2.3.3 HPLC-质谱（MS）法检测 取“2.2”项下大戟二烯醇自制品适量，加甲醇配制成质量浓度为100 μg/ml的溶液，精密吸取20 μl，使用液质联用仪进行检测。质谱条件：ESI 源，负离子模式，离子源电压4.5 V，采用总离子流（TIC）监测方式，扫描进样物质的TIC，扫描范围（m/z）为50～2 000，扫描间隔0.5 s，HPLC-MS 质量分数检查图谱见图3。由图3 可知，样品经HPLC 柱分离，仅产生一个显著的离子峰，该离子峰经选择性离子监测发现其为负离子m/z为426.7 的化合物，未见其他离子峰。

图3 大戟二烯醇的离子碎片1.大戟二烯醇Fig 3 Ion fragments of euphol1.euphol

2.4 结构鉴定

本品为无色针状晶体，mp 115～117 ℃（甲醇）；ESI-MS分子离子峰为425[M-H]－。1H-NMR（500 MHz，CDCl3）δ：5.05（1H，t，J＝2.3 Hz，H-12）、3.23（1H，dd，J＝5.7，10.35 Hz，H-3）、1.11（6H，s，2×CH3）、0.93（3H，d，J＝6.6 Hz）、0.89（3H，s）、0.84（3H，d，J＝6.6 Hz）、0.79（3H，s）、0.76（3H，s）、0.73（3H，s）。

13C-NMR（125 MHz，CDCl3）δ：38.03（C-1）、27.15（C-2）、79.11（C-3）、38.81（C-4）、55.56（C-5）、18.61（C-6）、32.57（C-7）、39.29（C-8）、48.12（C-9）、37.62（C-10）、23.56（C-11）、117.94（C-12）、145.48（C-13）、41.65（C-14）、25.07（C-15）、34.63（C-16）、40.06（C-17）、52.65（C-18）、22.83（C-19）、28.39（C-20）、60.12（C-21）、31.73（C-22）、28.06（C-23）、15.38（C-24）、15.28（C-25）、16.33（C-26）、22.22（C-27）、18.57（C-28）、22.50（C-29）、22.64（C-30）。

以上光谱数据经与文献[2]对照，确定该化合物为大戟二烯醇（C30H5O）。

3 讨论

京大戟常用于胸膜炎积水、腹水型晚期血吸虫病、肝硬化腹水及精神分裂症等，主产于湖南、江苏、山东等地，四川、福建、江西等地亦产[3-4]。

京大戟中主要含有三萜类、二萜类、黄酮类、生物碱、有机酸、鞣质、树脂胶和大戟色素体A、B、C 等成分，具有利尿、泻下、抗炎和抗肿瘤等药理作用。

本研究将大戟二烯醇作为京大戟的特征性指标成分并进行标准物质研究，专属性较强，制备方法简单可行，符合国家食品药品监督管理总局颁布的“中药新药质量标准用对照品研究的技术要求”的相关规定，可为京大戟药材和含京大戟的成方制剂的质量控制及药效物质基础研究奠定基础[2，5-9]。

[1]张乐林.京大戟炮制原理的初步研究[D].济南：山东中医药大学，2011.

[2]梁侨丽，戴传超，吴启南，等.京大戟的化学成分研究[J].中草药，2008，39（12）：1 779.

[3]孟庆安，徐志尧，刘秀书.大戟用药品种的探讨[J].天津药学，2007，19（6）：25.

[4]李伟，蔡霞，胡正海，等.大戟属药用植物的研究进展[J].中国野生植物资源，2008，27（5）：1.

[5]宗倩倩，唐于平，沈祥春，等.大戟科中药材的毒性作用研究进展[J].南京中医药大学学报，2008，24（4）：283.

[6]严亨波，肖新月，马双成，等.大戟科5 种有毒中药材的活性成分及质量标准研究进展[J].中国药师，2007，10（6）：544.

[7]姜文红，刘静，麻风华，等.京大戟石油醚提取部分化学成分的研究[J].中医药信息，2009，26（6）：15.

[8]郭增军，左建峰.九牛造化学成分研究[J].中药材，2007，30（4）：412.

[9]葛秀允，孙立立，张乐林.醋制前后京大戟饮片石油醚部位的HPLC 指纹图谱比较[J].中国药房，2013，24（39）：3 691.