光谱法研究头孢丙烯与牛血清白蛋白的相互作用Δ

刘 里，成飞翔（曲靖师范学院化学化工学院，云南曲靖 655011）

血清白蛋白是一类重要的运输性蛋白，在生物体内的循环系统中含量非常丰富，几乎占血清蛋白的60%。近年来采用光谱研究药物与血清白蛋白的相互作用已成为生命科学、化学、药学和临床医学领域的研究热点，这对于了解生命过程、药物作用机制及药物分子设计等都具有重要作用[1-4]。因结构上和人血清白蛋白的相似性，牛血清白蛋白（BSA）被广泛运用于与药物结合作用的研究。头孢丙烯（Cefprozil，CE）属第二代高效、低毒、耐酶头孢菌素类抗生素，常用于治疗敏感菌所致的轻、中度感染，包括上、下呼吸道感染，以及皮肤和皮肤软组织感染等[5]。因此，研究CE 与BSA 的相互作用对理解药物的作用机制具有重要意义。以往研究药物与BSA相互作用主要集中在猝灭机制探讨上，而本文在优化试验条件的情况下研究了CE与BSA的结合反应，除了常规的作用机制研究外，还深入探讨了不同温度下两者的结合位点、结合力类型、结合部位、药物之间的协同性以及药物对蛋白质构象的影响等，现报道如下。

1 材料

1.1 仪器

pHS-3C 型精密酸度计（上海虹益仪器仪表有限公司）；Cary50型紫外-可见分光光谱仪（美国瓦里安技术中国有限公司）；F-4600 型荧光光谱仪（日本日立公司，测定参数：狭缝宽度5 nm，光电倍增管负高压400 V）。

1.2 药品与试剂

CE（中国食品药品检定研究院，批号：130567-201203，纯度：94.9%）；牛血清白蛋白（上海楷洋生物技术有限公司，纯度：98%）；其余试剂均为分析纯，水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 猝灭试验

取10.0 ml比色管，加入BSA（1.0×10－5mol/L）2.0 ml，再分别加入9.490×10－5mol/L的CE溶液0.25、0.5、0.75、1、1.25、1.5、1.75、2、2.25、2.5、3 ml，然后加入三羟甲基氨基甲烷盐酸盐（Tris-HCl）溶 液（0.2 mol/L、pH 7.4）2.0 ml、NaCl 溶液（0.5 mol/L）2.0 ml（以维持正常生理离子强度），最后用水稀释至刻度并摇匀，分别在289、299、309 K 温度下作用50 min。此时体系中BSA 的浓度为2.0×10－6mol/L，CE 的浓度分别为0、0.237 3×10－6、0.474 5×10－6、0.711 8×10－6、0.949 0×10－6、1.186 3×10－6、1.423 5×10－6、1.660 8×10－6、1.898 0×10－6、2.135 3×10－6、2.372 5×10－6、2.847 0×10－6mol/L（编号依次为1～12）。作用完毕后立即以最大激发波长（λex）280 nm、最大发射波长（λem）342 nm在荧光光谱仪上记录荧光猝灭光谱，并分别以Δλ＝15、60 nm 绘制289 K温度下CE-BSA体系的同步荧光光谱，记录F0和F（F和F0分别指CE存在与不存在时BSA的荧光强度）。

2.2 荧光猝灭光谱

289 K温度下CE-BSA体系的荧光猝灭光谱见图1。

图1 289 K温度下CE-BSA体系的荧光猝灭光谱图Fig 1 Fluorescence quenching spectrogram of CE-BSA system at 289 K

由图1 可见，CE 在测量波段没有荧光，而BSA 的荧光较强。在λex/λem＝280/342 nm 处，当CE 加入到BSA 之后，虽然λex/λem几乎未发生变化，但是其荧光强度明显随着CE浓度的增加而逐渐减弱，表明CE 能猝灭BSA 的荧光，两者之间存在相互作用。

2.3 猝灭类型的判断

引起荧光猝灭的原因很多，但通常分为动态猝灭和静态猝灭。常用温度的改变而引起体系的变化来确定猝灭类型：在动态猝灭中分子扩散起主导，猝灭常数会随着温度的升高而增大；对于静态猝灭，因有新物质生成，稳定性起主导作用，温度越高，猝灭常数反而越小[6]。

2.3.1 Stern-Volmer 方程 动态猝灭过程应遵循Stern-Volmer方程：F0/F＝1+KSV[c]＝1+Kqτ0[c]，式中，KSV为动态猝灭常数，Kq为动态猝灭速率常数[动态猝灭时最大值约为2×1010L/（mol·s）][6]，τ0为荧光体平均寿命（一般为10－8s 数量级）[6]，[c]为CE 浓度。以289、299、309 K 时的F0/F对[c]作图，根据Kq＝KSV/τ0可求出不同温度下的Kq。不同温度下CE 对BSA 荧光猝灭的Stern-Volmer曲线见图2，Stern-Volmer方程及相关参数见表1。

图2 不同温度下CE-BSA体系的Stern-Volmer曲线Fig 2 Stern-Volmer curves of CE-BSA system at different temperatures

表1 不同温度下CE-BSA 体系的Stern-Volmer 方程及相关参数Tab 1 Stern-Volmer equations and correlative parameters of CE-BSA system at different temperatures

由表1可见，3个温度下的Kq比动态猝灭最大速率常数[2×1010L/（mol·s）]大2个数量级，说明CE对BSA的猝灭不属于动态猝灭。由图2 可知，3 个温度下的Stern-Volmer 曲线均呈良好的线性关系，且随着温度的升高，直线斜率即KSV减小，正好与静态猝灭机制一致。

2.3.2 Lineweaver-Burk方程 若CE对BSA为静态猝灭，应符合Lineweaver-Burk 方程[7-9]：（F0－F）－1＝F0－1+（KLBF0[c]）－1，式中，KLB为静态猝灭结合常数。以（F0－F）－1对[c]－1作不同温度下的Lineweaver-Burk 曲线。不同温度下FCE 对BSA 荧光猝死的Lineweaver-Burk 曲线见图3，Lineweaver-Burk 方程及相关参数见表2。

图3 不同温度下CE-BSA体系的Lineweaver-Burk曲线Fig 3 Lineweaver-Burk curves of CE-BSA system at different temperatures

由图3 可知，随着温度的升高，直线斜率逐渐增大，则KLB逐渐下降，这与因静态猝灭方式而形成的复合物随温度升高越不稳定的作用机制一致。由表2可知，3个温度下的KLB都在104数量级以上，表明CE 与BSA 由于发生静态猝灭而结合力较强。

表2 不同温度下CE-BSA体系的Lineweaver-Burk方程及相关参数Tab 2 Lineweaver-Burk equations and correlative parameters of CE-BSA system at different temperatures

2.3.3 紫外吸收光谱[7-9]按“2.1”项下方法制备289 K下作用50 min 的CE-BSA 体系1～12，以相应浓度的CE 为参比，在紫外-可见光谱仪上对体系进行紫外光谱扫描，得到CE 与BSA结合后的紫外吸收光谱图。紫外吸收光谱见图4。

图4 紫外吸收光谱图Fig 4 UV absorption spectrum

由图4 可见，CE 的加入使BSA 中苯环上的π-π＊跃迁引起的特征吸收峰从280 nm 移到274 nm，吸收强度也随CE 浓度的增加而增加。CE 的加入引起BSA 紫外吸收光谱的变化这一现象，说明CE与BSA间发生反应，有新物质生成，更进一步证明两者之间的相互作用机制属于静态猝灭机制。

2.4 结合常数和结合位点数的计算

如CE与BSA存在n个等同且独立的结合位点，其相互作用的关系应符合双对数方程：lg[（F0－F）/F]=lgKb+nlg[c]。分别在289、299、309 K 温度下，以lg[（F0－F）/F]对lg[c]作图，以直线的斜率和截距求出CE 与BSA 不同温度下的结合常数（Kb）和结合位点数（n）。不同温度下lg[（F0－F）/F]-lg[c]曲线见图5，不同温度下CE 对BSA 荧光猝灭的双对数方程及相关参数见表3。

图5 不同温度下CE-BSA体系的lg[（F0－F）/F]-lg[c]曲线Fig 5 lg[（F0－F）/F]-lg[c]curves of CE-BSA system at different temperatures

表3 不同温度下CE-BSA体系的双对数方程及相关参数Tab 3 Double logarithmic equations and correlative parameters of CE-BSA system at different temperatures

由表3 可见，3 个温度下的n都约等于1，表明CE 与BSA结合后可形成一个结合位点。随着温度增加，Kb和n值减少的程度不大，表明CE 与BSA 的相互作用对温度变化不是很敏感。这说明温度的提升不利于血清白蛋白携带着CE 在体内进行运转、贮存和分配。

2.5 热力学常数和作用力类型判断

根据热力学公式[10]计算289、299、309 K温度下CE与BSA结合反应的焓变（ΔH）、熵变（ΔS）及吉布斯自由能变（ΔG），结果见表4。

表4 不同温度下CE与BSA相互作用的热力学参数Tab 4 Thermodynamic parameters of the interaction between CE and BSA at different temperatures

由表4 可见，ΔG＜0，表明BSA 与CE 的反应能自发进行；ΔH＜0，表明反应为放热反应；ΔH＜0且ΔS＜0，表明氢键和范德华力是CE与BSA的主要结合作用力。

2.6 结合位置的确定

应用Maciazek-Jurczyk M、刘保生、梁宏等[11-13]提出的方法，比较激发波长为280、295 nm 时CE-BSA 体系荧光程度的变化情况。CE-BSA体系的荧光猝灭曲线见图6。

图6 CE-BSA体系的荧光猝灭曲线Fig 6 Fluorescence quenching curves of CE-BSA system

由图6 可知，280、295 nm 激发波长下，CE 对BSA 的猝灭程度曲线没有重叠，说明色氨酸和酪氨酸残基都参与其中。对比这两种波长下的荧光猝灭程度可知，在280 nm 激发时降低程度更大些，这说明在CE 与BSA 的结合过程中，结合位点主要位于亚螺旋域ⅡA。

2.7 药物协同性考察

Maciazek-Jurczyk M、刘保生、梁宏等[11-13]认为药物协同性是指药物与具有多重结合部位的BSA 结合过程中各结合部位之间可能存在相互影响作用，可用Hill 方程进行分析：lg[H/（1－H）]＝lgKH+nHlg[c]，式中，H为结合饱和分数，KH为结合常数，nH为Hill 系数。在荧光试验中：H/（1－H）=B/（Bm－B），其中，B为（F0－F）/F0；1/Bm为1/B对1/[c]作图的截距。不同温度下CE-BSA体系的nH值结果见表5。

表5 不同温度下CE-BSA体系的nH值Tab 5 The value of nHof CE-BSA system at different temperatures

由表5可知，3个温度下的nH都略小于1，表现为弱的负协同作用，说明CE与BSA结合过程中，随着配体CE不断地结合到位点，使得后继配体对BSA的亲和性减弱，即前一个药物分子结合到BSA位点上后，对后一个药物分子与BSA的结合起到了阻碍作用。随着温度的变化，虽然nH变化不大，但也随温度升高而降低，说明温度的提升对CE药物小分子之间的协同作用不利。

2.8 CE对BSA构象的影响

在Δλ＝15 nm 和Δλ＝60 nm 的条件下，测得CE-BSA 体系的同步荧光光谱见图7。

图7 CE猝灭BSA的同步荧光光谱图Fig 7 Synchronous fluorescence spectrogram of CE quenching BSA

由图7 可知，随CE 浓度的增大，这两种氨基酸残基的λmax几乎没有发生移动，说明CE的加入几乎不对BSA 构象产生影响[11-13]。酪氨酸的猝灭程度大于色氨酸，表明CE 与BSA 相结合的位点偏向于酪氨酸。

3 讨论

用荧光光谱和紫外吸收光谱法推断出CE 对BSA 荧光产生静态猝灭，CE 和BSA 之间的作用力类型主要为静电作用力；CE 与BSA 可形成1 个结合位点，表明CE 可被BSA 运输；nH＜1，表明CE 对结合反应产生负协同作用，即CE 加入使BSA 的亲和性增强，有利于后续CE 与BSA 的结合，结合部位在BSA 的亚螺旋域ⅡA 中。同步荧光光谱表明CE 几乎不对BSA 构象产生影响，结合位点靠近酪氨酸残基。该研究结果为了解CE 在体内的运输和代谢过程、毒性机制提供了重要信息。

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