MSC复合生物材料促进缺血性糖尿病溃疡愈合的研究

柏　力，杨明璨，谭　菊，孙建森　(.昆明军区总医院急诊科，云南 昆明 650000；.第三军医大学人体解剖学教研室,重庆 400038)

MSC复合生物材料促进缺血性糖尿病溃疡愈合的研究

柏力1，杨明璨2，谭菊2，孙建森2(1.昆明军区总医院急诊科，云南 昆明 650000；2.第三军医大学人体解剖学教研室,重庆 400038)

[摘要]目的观察MSC复合生物材料对缺血性糖尿病溃疡愈合的作用，探讨干细胞复合生物材料的临床应用前景。方法制作电纺丝生物材料，培养MSC细胞，通过电镜观察、增殖实验及条件培养基对内皮细胞的作用研究MSC复合生物材料的离体效果。并使用5～8周龄雄性C57BL/6J小鼠制备成糖尿病小鼠，结扎股动脉近端，在大腿背侧皮肤造成直径5 mm全层创面。观察MSC复合生物材料治疗糖尿病足缺血性溃疡的效果。结果本研究发现将MSC种植与生物电纺丝材料上，通过扫描电镜观察，细胞生长良好，细胞足伸展，细胞间连结建立。高糖刺激下，MSC在生物材料上具有更强的生长增殖能力。利用MSC在生物材料上生长的条件培养基作用人脐静脉内皮细胞，发现内皮细胞增殖能力增强。将单独的MSC和MSC复合生物材料覆盖在糖尿病小鼠大腿皮肤损伤处，发现MSC复合生物材料能够有效提高MSC对糖尿病足溃疡的治疗效果，促进伤口愈合,有利于血管生成。结论MSC复合生物材料能够促进糖尿病足缺血性溃疡愈合。提示干细胞复合生物组织材料在加速糖尿病足等缺血性溃疡愈合方面具有很大治疗潜力和应用前景。

[关键词]间质干细胞(MSC);生物材料;缺血性糖尿病溃疡;血管生成

随着糖尿病患者的急剧增多，难治性糖尿病足的发病率也逐年攀升[1-2]。糖尿病足伤口由于失去了正常伤口愈合的机制和过程，常导致伤口愈合障碍[3-4]。该发病机制尚不完全清楚，目前的研究认为糖尿病性周围血管、神经病变导致局部缺血性溃疡是其主要致病因素[5]。当前利用干/祖细胞等进行糖尿病足的细胞治疗成为研究热点[6-7]。但单纯细胞治疗存在细胞生长微环境不易改善，细胞生长困难等局限[8]，因此迫切期待新型促进血管新生的有效方案治疗糖尿病足等缺血性溃疡。

间质干细胞(mesenchymal stem cells,MSC)是干细胞家族的重要成员，因其具有多向分化潜能在人类疾病中应用非常广阔[9]。在心血管系统，MSC可以通过旁分泌机制发挥对缺血心肌的保护作用[10]，还可分泌促动脉新生的多种细胞因子[11]。但单纯间充质干细胞移植治疗糖尿病足效果不佳。随着生物材料在医药行业的快速发展，依赖生物材料实现药物或细胞的靶向输送和附着成为研究的热点。将间充质干细胞复合生物材料移植到糖尿病足创面治疗是否能够提高治疗效果，目前尚不清楚。我们将MSC种植在新型生物组织材料上，治疗小鼠糖尿病足，观察其伤口愈合的效果，分析其作用机制,为进一步研究奠定基础。

1材料与方法

1.1细胞培养及实验分组

人骨髓间质干细胞和人脐静脉内皮细胞(HUVEC)均购自Cyagen Biosciences(Guangzhou，China)。使用α-MEM，L-谷氨酰胺(2 mM)(all purchased from Hyclone Laboratories,USA)，青霉素(100 U/mL)，链霉素(100 mg/mL)(all purchased from Sangon.Com,China)和10%FBS(Gibco，USA)作为MSC基本培养基。含25 mM葡萄糖分别为MSC高糖培养基。RPMI-1640培养基(Hyclone Laboratories,USA)，10%FBS(Gibco,USA)作为HUVEC基本培养基，30 mM葡萄糖分别为HUVEC低糖或高糖培养基[6]。HUVEC实验按CM类型而分组。

1.2MSC在材料上的观察

接种8×103个MSC于生物材料上，37 ℃，5%CO2孵育48 h，采用扫描电镜进行观察。

1.3细胞增殖实验

使用MTT法检测MSC或HUVEC增殖能力。MSC单独培养或者在生物材料上培养48 h，每孔加入20 μl的5mg/mL MTT(Sigma)，孵育4 h，更换150 μl DMSO(Sigma)，使用Emax酶标仪(Molecular Devices)，用492 nm波长测定每个样品吸光度。HUVEC传代后，添加1∶5稀释的条件培养基[6]，培养48 h，每孔加入20 μl的5 mg/mL MTT(Sigma)，孵育4 h，更换150 μl DMSO(Sigma)，使用Emax酶标仪(Molecular Devices)，用492 nm波长测定每个样品吸光度。

1.4动物实验

按第三军医大学(Chongqing，China)颁布的动物实验条例进行动物实验，并得到第三军医大学伦理道德委员会批准。使用5～8周龄雄性C57BL/6J小鼠(第三军医大学实验动物中心)，腹腔注射40 mg/kg链脲佐菌素(STZ，Sigma)，连续5 d，空腹血糖大于16.7 mmol/L为糖尿病小鼠[12]。制作糖尿病足模型[13]。结扎股动脉近端，电凝小分支止血，使下肢缺血，在大腿背侧皮肤造成直径5 mm全层创面。MSC复合生物组织材料覆盖于伤口区或直接将MSC滴附在伤口处，30 min后均使用TegadermTM透明敷料(Minnesota Mining and Manufacturing,USA)包扎。手术后，给予小鼠充足的食物和饮水，在恒温、恒湿的环境中单独饲养。

1.5伤口愈合效果和组织学观察

手术7 d后使用Nikon D90数码相机(JaPan)，拍摄伤口，用IPP软件分析伤口面积。按观察时间切取伤口区皮肤，4%多聚甲醛固定，9 μm冰冻切片，进行伊红-苏木精(H-E)染色。使用OLYMPUS BX50显微镜，对HE染色的切片，随机选取10个视野(200×)，采用VERSOI 4.6软件拍摄图像。对伤口处的毛细血管密度进行组织学定量分析。

1.6统计

2结果

2.1MSC在生物电纺丝材料上生长良好

将MSC种植于生物电纺丝材料上，培养48 h后进行扫描电镜观察。可见电纺丝生物材料纤维规则，孔隙均匀。MSC呈集落分布，生长良好，细胞附着于生物电纺丝材料的孔隙中，细胞足长出，细胞间建立了细胞连结(图1)。

a:电纺丝生物材料扫描电镜;b:MSC种植与电纺丝生物材料上培养48 h

图1MSC在生物电纺丝材料上生长情况

2.2高糖培养下MSC在生物电纺丝材料上的增殖能力

使用MTT法探讨MSC高糖培养基对MSC的增殖作用，发现MSC在生物材料上使用高糖培养基培养48 h后，其OD值是对照组的1.4倍(图2a)。这提示高糖环境下，间充质干细胞在生物材料上能够更好地实现复制与增殖。

a：MSCs增殖的OD值比较，*:P<0.05，N=5;b:HUVECs在MSCs条件培养基中的增殖的OD值比较,*:P<0.05，N=5

图2MSCs与HUVECs在不同条件下的增殖情况

2.3条件培养基对血管内皮细胞的增殖作用

为了解MSC条件培养基对HUVEC的增殖影响，使用MTT法发现，在HUVEC高糖环境下，相对于MSC条件培养基组，MSC+生物材料条件培养基组HUVEC增殖的OD值是前者的1.5倍(图2b)。结果提示，高糖环境下材料上生长的MSC具有更好的旁分泌功能，其分泌的活性因子进入条件培养基能够提高血管内皮细生存和增殖能力。

2.4MSC复合生物材料加速糖尿病足愈合

为明确MSC复合生物材料是否具有促糖尿病足愈合的作用，我们制作了糖尿病足小鼠模型，伤口处覆盖含有2×104cell MSC复合生物材料(治疗组)或2×104cell MSC(对照组)。从手术开始，分别在术后即时和第7 天测量伤口面积。发现MSC复合生物材料治疗组糖尿病足的愈合速度明显加快，而MSC对照组的愈合率相对缓慢(图3)，治疗效果具有显著差异(P<0.01)。

a:MSC组手术后即时创面;b:MSC复合生物材料组手术后即时创面;c:MSC组手术后7 d创面;d:MSC复合生物材料组手术后即时创面

图3MSC复合生物材料治疗糖尿病足溃疡情况

2.5MSC复合生物材料促血管再生作用

血管新生是伤口愈合的关键事件[3-4]，为确定MSC复合生物材料促进糖尿病足血管新生的能力，我们对第7 d伤口周围皮肤进行H-E染色。结果显示，与MSC组相比，MSC复合生物材料组血管密度明显增高(图4)。说明MSC复合生物材料能够促进血管生成。

a:MSC组手术后7 d皮肤切片HE染色;b:MSC复合生物材料组手术后7 d皮肤切片HE染色。

图4皮肤修复的病理染色

3讨论

全世界范围内，每年有1.0%～4.1%的糖尿病患者发生不同程度的足部溃疡，截肢率达到0.21%～1.37%，糖尿病足导致的截肢已经成为非外伤截肢的最主要原因[14]。目前的研究认为糖尿病足的发生主要是神经、血管病变、感染相互作用的结果。初始阶段，周围神经和血管病变是导致糖尿病患者发生糖尿病足的主要原因，当局部溃疡形成之后，溃疡局部组织的过度炎症也成为糖尿病足进行性加重的主要原因之一。由于糖尿病足溃疡丧失了正常伤口愈合的过程和机制，因此，伤口愈合存在障碍。糖尿病足的传统治疗主要有营养治疗和内科治疗。但是，大量临床结果表明，随着时间的推移，传统的治疗只能减缓糖尿病足的进展，并且作用微乎其微。细胞反应或炎症介质等互相作用，有效参与伤口愈合过程[15]，血管新生是伤口愈合的关键部分[3-4]。针对糖尿病足病变特点，有效促使血管新生是解决问题的有效办法。

间质干细胞既具有多分化性[16]，又可以分泌IGF-1、bFGF、VEGF、IL-6等多种促动脉生长因子[11]。但是面对高糖的微环境，间充质干细胞的功能受到抑制。干细胞治疗虽然具有一定的优势，但是，随着时间的进展，单因素治疗糖尿病足的效果逐渐不尽人意。为了提高干细胞治疗的疗效，目前已经开发出了各种新型生物材料作为干细胞的载体，虽然取得了一定的效果，但是依然不能达到我们的预期。我们利用组织工程技术，人间质干细胞复合生物电纺丝材料，发现MSC能够在高糖环境下更好地生长增殖。并且其条件培养基能够更好地促进内皮细胞的生长和增殖，这为加速糖尿病足血管新生，促进伤口愈合奠定了基础。MSC在生物材料上良好生长并相互连结，是否能够抵御高糖的损伤值得深入研究，其机制有待进一步阐明。

通过生物材料复合MSC移植到糖尿病足创面后，细胞能够锁定在生物材料中较好发挥其旁分泌功能和多向分化的潜能，较单独细胞移植，提高了促进伤口愈合的治疗效果。本研究虽然观察周期比较短，但是已经出现促进血管新生和伤口愈合的良好效果，提示应用干细胞生物组织工程技术治疗糖尿病足等缺血性溃疡具有重大发展潜力。这给我们带来了治疗糖尿病足的希望，下一步拟研究其长期作用效果及其机制。

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(编辑：周小林)

Research of MSC-seeded biomaterials promoting ischemic diabetic ulcers repair

BAI LI1,YANG Ming-can2,TAN Ju2,SUN Jian-sen2(1.Department of Emergency,General Hospital of Kunming Military District,Kunming Yunnan 650000,China;2.Department of Anatomy,Third Military Medical University,Chongqing 400038,China)

Abstract:ObjectiveTo observe the effect of mesenchymal stem cells (MSC) in treating ischemic diabetic ulcers, and to explore its clinical perspectives. MethodsPrepared electro-spinning biomaterials and cultured MSC to study effect of MSC composite biomaterials in vitro by scanning electron microscope,MTT array and influence of MSC conditioned medium on endothelial cells. The use of 5 to 8 week old male C57BL/6J mice were prepared into diabetic mice,femoral artery ligation in the proximal thigh,in dorsal skin full-thickness wounds caused by the diameter 5 mm. Then the effect of MSC composite biomaterials on ischemic diabetic ulcers was determined.ResultsThis study found that the MSC grow well on electro-spinning biomaterials. Cells foot extension and connections between cells were observed by scanning electron microscope. Stimulated by high glucose,growth and proliferation of MSC has a stronger ability on biomaterials. MSC conditioned medium on biomaterials increased human umbilical vein endothelial cells proliferation ability. ConclusionMSC composite biomaterials can effectively improve the treatment effect of MSC on ischemic diabetic ulcers. The study indicated stem cells composite biomaterials have great potential and application prospect in the treatment of ischemic diabetic ulcers healing.

Keywords:mesenchymal stem cells (MSC);biomaterials;ischemic diabetic ulcers;angiogenesis

[收稿日期]2015-03-21[修回日期] 2015-05-15

[基金项目]国家自然科学基金资助项目(31200731)

doi:10.11659/jjssx.01E015043

[中图分类号]R587.2

[文献标识码]A

[文章编号]1672-5042(2015)04-0370-04