Rho激酶和PKC在环孢素A改善休克血管反应性中的作用及与MPTP的关系

雷　艳，杨新征，董昭君　(.第三军医大学卫勤训练基地医学综合教研室，重庆 40008；.解放军第医院病理科，吉林 吉林 0；.第三军医大学军事预防医学院毒理学研究所，重庆 40008)

·论著·

Rho激酶和PKC在环孢素A改善休克血管反应性中的作用及与MPTP的关系

雷艳1，杨新征2，董昭君3(1.第三军医大学卫勤训练基地医学综合教研室，重庆 400038；2.解放军第222医院病理科，吉林 吉林 132011；3.第三军医大学军事预防医学院毒理学研究所，重庆 400038)

[摘要]目的观察Rho激酶和PKC在环孢素A(CsA)改善创伤失血性休克大鼠血管反应性中的作用及与线粒体通透性转换孔(MPTP)开放的关系。方法采用创伤失血性休克大鼠模型和缺氧培养的血管平滑肌细胞(VMSC)，观察了Rho激酶和PKC在CsA调节休克血管反应性中的作用，以及对血管平滑肌细胞线粒体MPTP开放的影响，同时观察CsA对休克动物炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-6水平的影响。结果CsA明显改善了休克血管反应性，Rho激酶抑制剂Y27632可显著拮抗CsA恢复休克血管反应性的作用，但是PKC抑制剂staurosporine对CsA的作用无明显影响。CsA和Rho激酶激动剂U46619都可抑制缺氧后线粒体MPTP的开放程度。休克后大鼠血液中TNF-α和IL-1β的浓度均显著增加，但CsA处理仅使其轻微减少。结论CsA可以通过抑制线粒体MPTP开放改善休克后血管的低反应性，发挥对创伤休克的治疗作用。Rho激酶参与了这其中的调节过程。

[关键词]线粒体通透性转换孔；环孢素A；血管反应性；创伤失血性休克；Rho激酶

环孢素A(CsA)是一种临床常见的强效免疫抑制剂。我们前期的研究发现CsA对休克有一定的治疗作用，其作用主要通过改善休克后血管反应性和器官血流灌注来实现[1]。但是，CsA调节血管反应性的具体机制尚不清楚。Rho激酶(Rho associated serine/threonine kinase)和蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)是重要的血管平滑肌细胞舒缩功能调节分子，在休克后血管反应性调节中发挥着重要作用。近年来的研究证实，CsA可以通过抑制线粒体通透性转换孔(mitochondrial permeability transition pore，MPTP)的开放，改善心、脑等器官的缺血再灌注损伤[2-3]。那么，CsA调节血管反应性是否与Rho激酶或PKC有关，其作用是通过免疫抑制或是抑制MPTP开放而发挥，目前尚不明确。本文采用了创伤失血性休克大鼠模型，观察CsA对休克后炎症介质水平的影响及Rho激酶和PKC在CsA调节血管反应性中的作用，并利用细胞实验观察其与MPTP开放的关系，进一步探讨CsA发挥抗休克作用的具体机制。

1材料与方法

1.1实验动物及主要试剂

SD大鼠，体质量(200±20)g，由第三军医大学野战外科研究所实验动物中心提供。U46619 (Rho激酶激动剂)、Y27632 (Rho激酶抑制剂)、PMA(PKC激动剂)、Staurosporine(PKC抑制剂)购自美国Sigma公司，Calcein-AM、MitoTracker deep red购自美国Invitrogen公司，TNF-α、IL-1β和IL-6检测试剂盒购自欣博盛生物科技有限公司。

1.2炎症介质水平检测

32只SD大鼠随机分为4组，每组8只，分别为：①正常对照组(sham-operated)；②休克组(shock)；③乳酸林格氏液(LR)组；④CsA组(CsA 5 mg/kg)。采用3%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后，将大鼠单侧股骨折断，经股动脉插管放血，使血压维持在40 mmHg，持续3 h，建立创伤失血性休克模型。休克3 h后，LR组经股静脉输注2倍失血量的LR，CsA组将5 mg/kg的CsA加入LR中输注。复苏2 h后取2 mL血液，采用检测试剂盒测定TNF-α、IL-1β和IL-6的含量。

1.3血管反应性测定

SD大鼠64只，随机分为8组，每组8只。实验分组为：①Sham组(正常对照组)；②Shock组(休克处理组)；③LR组(休克+LR)；④CsA组(休克+LR+CsA 5 mg/kg)；⑤CsA+U46619组(休克+LR+CsA 5 mg/kg+Rho激酶激动剂U46619 10-8mol/L)；⑥CsA+Y27632组(休克+LR+CsA 5 mg/kg+Rho激酶抑制剂Y27632 10-6mol/L)；⑦CsA+PMA组(休克+LR+CsA 5 mg/kg+PKC激动剂PMA 10-7mol/L)；⑧CsA+Staurosporine组(休克+LR+CsA 5 mg/kg+PKC抑制剂Staurosporine 10-7mol/L)。

以相同方法建立休克模型，休克处理3 h后给予CsA 5 mg/kg复苏，随后取大鼠肠系膜上动脉，制备血管环。CsA组在CsA 5 mg/kg复苏后，直接取血管环测定反应性；CsA+U46619组、CsA+Y27632组、CsA+PMA组、CsA+Staurosporine组在CsA 5 mg/kg复苏后，取血管环平衡后，分别用U46619、Y27632、PMA和Staurosporine孵育30 min，再观察血管环的反应性。将血管环置于K-H液中平衡2 h，待张力曲线平稳后，测定血管环对去甲肾上腺素(NE)的收缩反应性。

1.4线粒体MPTP开放情况检测

取SD大鼠的肠系膜上动脉进行血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell，VSMC)原代及传代培养，以缺氧处理的VSMC模拟休克后缺血缺氧状态[4]。实验分为4组：①正常对照组(Normal)；②缺氧组(Hypoxia)；③缺氧+CsA组(缺氧+CsA 1 μmol/L)；④缺氧+Rho激酶激动剂组(缺氧+U46619 10-8mol/L)。

将大鼠肠系膜上动脉的VSMC接种于共聚焦显微镜专用的培养皿中，移入缺氧培养罐内，充入缺氧气体(95%N2和5%的CO2)，达到完全缺氧后开始计时，缺氧处理3 h。缺氧+CsA组在缺氧处理后以1 μmol/L的CsA孵育2 h，Rho激酶激动剂组以U46619(10-8mol/L)孵育30 min。采用calcein-CoCl2法，以MitoTracker deep red定位细胞线粒体，通过激光共聚焦显微镜(Calcein 488 nm，MitoTracker 644 nm)检测线粒体MPTP开放情况。以线粒体中绿色荧光的强度变化反映MPTP的开放程度，荧光强度高反映MPTP开放水平低，荧光强度低反映MPTP开放增加。

1.5统计学处理

2结果

2.1CsA对休克后TNF-α、IL-1β和IL-6水平的影响

休克后大鼠血液中TNF-α和IL-1β的浓度均明显增加，显著高于正常对照组(P<0.01)，输注LR可使TNF-α和IL-1β浓度进一步增加。给予CsA(5 mg/kg)仅轻微降低了TNF-α和IL-1β浓度，与LR组之间没有显著差异。各组的IL-6浓度在休克处理和复苏治疗前后均未出现明显变化(图1)。

*：与Sham组比较，P<0.01

2.2CsA调节休克血管反应性与Rho激酶及PKC的关系

休克后大鼠的血管反应性显著降低，CsA(5 mg/kg)可明显恢复休克后血管反应性，效果明显优于单纯LR液复苏(P<0.01)。Rho激酶抑制剂Y27632(10-6mol/L)可显著抑制CsA升高休克血管收缩反应的作用，最大收缩张力较CsA组显著降低(P<0.01)；Rho激酶激动剂U46619(10-8mol/L)可使CsA升高休克血管收缩功能的作用进一步增加(图2)。PKC激动剂PMA(10-7mol/L)和抑制剂Staurosporine(10-7mol/L)对CsA调节休克血管的反应性无显著影响。

2.3CsA和Rho激酶对缺氧VSMC线粒体的影响

缺氧处理后，VSMC的荧光强度较正常对照组明显减弱(P<0.01)，提示缺氧后线粒体MPTP开放显著增加。CsA(1 μmol/L)和Rho激酶激动剂U46619(10-8mol/L)可抑制缺氧后线粒体MPTP的开放程度，其荧光强度明显高于缺氧组(P<0.01)，见图3。

3讨论

CsA是一种有效的免疫抑制剂，在临床上常用于器官移植术后和许多自身免疫疾病的治疗。相关研究结果提示，CsA可以通过改善休克后血管反应性和器官血流灌注，对创伤失血性休克的治疗起到一定的积极作用[5-6]，但是其具体机制尚不清楚。有研究报道，创伤失血性休克可以引起炎症应答反应，炎症因子水平升高，导致组织器官损伤。那么，CsA在创伤失血性休克治疗中的作用是否也与抑制这种免疫应答相关，目前尚无明确报道。为此，我们在实验中观察了CsA治疗前后炎症介质TNF-α、IL-1β和IL-6的变化情况。结果发现，TNF-α、IL-1β水平在休克后显著增高，输注CsA后仅能使其轻微降低，而IL-6水平在CsA治疗前后没有明显改变。这一结果说明，在抗休克治疗中，短时间给予适宜剂量的CsA不会对免疫因子产生明显的抑制作用。CsA在抗休克治疗中的有益作用主要通过调节血管反应性而实现，而并非通过免疫抑制。

血管低反应性是影响休克治疗效果的重要因素之一[7-8]。血管低反应性导致微循环障碍，组织缺血缺氧状态得不到很好地缓解，组织损伤将进一步加剧。所以，改善血管低反应性是休克复苏治疗的重要措施之一[9-11]。蛋白激酶C(PKC)和Rho激酶是G蛋白偶联受体系统中的效应物。PKC既可以通过激活细胞质中的靶酶参与生化反应的调控，也能作用于细胞核中的转录因子，参与基因表达的调控[12-13]。PKCα和PKCε可以通过调节肌球蛋白轻链磷酸酶活性，影响肌球蛋白轻链磷酸化水平，对血管的反应性和钙敏感性起到调节作用[14]。Rho激酶是Rho蛋白主要的下游效应靶分子，是调节细胞运动的重要激酶之一[15]。Rho激酶激活后可以通过激活下游的肌球蛋白轻链激酶，或抑制肌球蛋白轻链磷酸酶活性，增加肌球蛋白轻链的磷酸化水平，调节血管平滑肌细胞收缩[16]。通过前期研究[17]我们发现PKC和Rho激酶在休克后血管反应性的调节中具有重要作用。在本实验中，我们观察了CsA对休克血管反应性的调节作用及其与Rho激酶及PKC的关系。实验结果显示，CsA可以明显恢复休克后的血管功能，Rho激酶的抑制剂可显著抑制CsA升高休克血管收缩反应的作用，Rho激酶激动剂可进一步增加CsA升高休克血管收缩反应的作用。提示Rho激酶可能参与了CsA调节休克后血管功能的过程。

*：与Sham组比较，P<0.01；#：与LR组比较，P<0.01；△：与CsA组比较，P<0.01

图2各组对去甲肾上腺素的收缩反应性变化

*：与Normal组比较，P<0.01；#：与Hypoxia组比较，P<0.01

图3各组的荧光强度比较

有研究[18-20]发现，CsA可以通过与Cyp D相结合，抑制线粒体MPTP的开放，发挥对MPTP开放所造成的组织细胞缺血性损害等的保护和治疗作用。在本实验中，我们以缺氧处理的VSMC模拟休克后血管的缺血缺氧状态，探讨CsA调节休克血管的反应性是否与抑制MPTP开放有关。我们观察到，缺氧处理使VSMC的MPTP开放显著增加，CsA和Rho激酶激动剂可以抑制缺氧后MPTP的开放。实验结果提示，CsA可以通过抑制线粒体MPTP开放来改善休克后血管反应性，从而发挥抗休克作用，Rho激酶可能参与了这一过程的调节。

综上所述，在创伤失血性休克的治疗中，CsA可通过抑制线粒体MPTP开放，改善休克后血管的低反应性，改善组织血液灌注和器官功能而发挥有益作用，并非通过免疫抑制途径。Rho激酶可能参与了这其中的调节过程。但是，Rho激酶在这一过程中的具体作用及其与线粒体MPTP开放的关系如何，还需要更深入的研究来证实。

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(编辑：周小林)

Role of Rho-kinase and PKC in cyclosporine A regulating vascular reactivity and it relationship to MPTP after traumatic hemorrhagic shock

LEI Yan1,YANG Xin-zheng2,DONG Zhao-jun3(1.Department of General Medicine,Medical Service Training Base, Third Military Medical University,Chongqing 400038,China;2.Department of Pathology,the 222th Hospital of PLA,Jilin Jilin 132011,China;3.Institute of Toxicology,College of Military Preventive Medicine,Third Military Medical University,Chongqing 400038,China)

Abstract：ObjectiveTo investigate the relationship of the beneficial effect of CsA on vascular reactivity to Rho-kinase,protein kinase C (PKC) and mitochondrial permeability transition pore (MPTP) in traumatic hemorrhagic shock rats. MethodsWith traumatic hemorrhagic shock rats and hypoxia-treated vascular smooth muscle cells (VSMCs),the role of Rho-kinase and PKC in CsA-regulating vascular reactivity following shock and their relationship to MPTP was observed.Meanwhile,the effects of CsA on inflammatory mediators including TNF-α,IL-1β and IL-6 were also studied. ResultsCsA significantly improved the vascular reactivity of superior mesenteric artery following hemorrhagic shock.Rho-kinase inhibitor Y27632 significantly antagonized CsA-induced increase of vascular reactivity,while PKC inhibitor staurosporine had no significant influences on the effects of CsA.Further studies showed that CsA and Rho-kinase agonist U46619 inhibited the opening of MPTP in hypoxia-treated VSMCs.In addition,shock induced a significant increase of TNF-α and IL-1β,but CsA did not show a significant inhibitory effect on their level. ConclusionCsA-induced restoration of vascular reactivity following traumatic hemorrhagic shock via inhibiting MPTP opening,and Rho-kinase participate in this process.

Keywords：mitochondrial permeability transition pore;cyclosporine A;vascular hyporeactivity;traumatic hemorrhagic shock;Rho associated serine/threonine kinase

[收稿日期]2015-03-10[修回日期] 2015-04-16

[基金项目]国家自然科学基金(81270400)

doi:10.11659/jjssx.03E015007

[中图分类号]R605.971

[文献标识码]A

[文章编号]1672-5042(2015)04-0355-04