半乳糖凝集素3与Bcl-2在溃疡性结肠炎患者大肠黏膜中的应用研究＊

张启芳，李晓燕，王媛媛，李西融，陈卓琳，郑 奕，何思明，陈勇昌，姜海行△

（1.广西医科大学第一附属医院消化内科，南宁530021；2.广西壮族自治区南溪山医院消化内科，广西桂林541002；3.广西壮族自治区南溪山医院病理科，广西桂林541002）

半乳糖凝集素3（Galectin-3，Gal-3）是一种生物体内通过识别特异性半乳糖配基而发挥功能的糖蛋白，参与细胞黏附、增殖、分化、血管生成、凋亡等多种生物功能[1]。B淋巴细胞瘤-2基因（B cell leukemia／lymphoma-2，Bcl-2）是细胞凋亡的抑制基因，它的激活和过度表达能抑制细胞的正常凋亡[2]。溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）是肠道慢性非特异性炎症性疾病，其病因和发病机制至今尚未完全阐明，越来越多的证据显示细胞凋亡在UC组织损伤和免疫功能紊乱中起着重要的作用[3]。Gal-3与Bcl-2在结构上相似，可能在细胞凋亡中存在共同的凋亡途径。本文采用免疫组织化学SP法检测UC患者大肠黏膜组织中Gal-3和Bcl-2的表达，探讨两者在UC发病中的作用及关联性。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2009年1月至2013年6月在广西壮族自治区南溪山医院及广西医科大学第一附属医院消化内科住院或门诊确诊的UC患者60例（UC组）为研究对象，其中男39例，女21例，年龄17～77岁，平均（44.25±12.43）岁。健康体检例行肠镜检查者20例（对照组）为对照，其中男10例，女10例，年龄20～66岁，平均（43.60±13.18）岁。全部病例均符合中华医学会消化病分会炎症性肠病协作组制定的《对我国炎症性肠病诊断治疗规范的共识意见》[4]。病变按Riley等分级法，根据肠镜下UC的表现，将病变程度分为Ⅰ级、Ⅱ级、Ⅲ级。Ⅰ级：黏膜充血，黏膜下血管网不清，有淤斑；Ⅱ级：黏膜明显充血水肿，黏膜呈细颗粒状、质脆，有小溃疡形成；Ⅲ级：黏膜粗糙呈颗粒状，有自发性出血，浅小溃疡融合，覆有少量的黏液脓血及血性渗出物[5]。病例分为3组：Ⅰ级组21例，Ⅱ级组20例，Ⅲ级组19例。研究方案经广西壮族自治区南溪山医院及广西医科大学第一附属医院伦理委员会批准，并取得研究对象知情同意。所有标本在患者行结肠镜检查时活检留取，取乙状结肠和（或）直肠黏膜组织，10%中性福尔马林液固定，石蜡包埋保存。正常对照者在乙状结肠和（或）直肠活检。

1.2 方法

1.2.1 Gal-3与Bcl-2的检测 应用免疫组织化学SP法检测Gal-3与Bcl-2在患者大肠黏膜组织中的表达。一抗为兔抗人Gal-3或Bcl-2多克隆抗体，购自ABGENT公司；二抗为辣根过氧化物酶HRP标记亲和纯化山羊抗兔IgG（H＋L），购自Jackson Immunoresearch公司。具体方法：石蜡切片常规脱蜡、水化，PBS冲洗，灭活内源性过氧化物酶，高温高压抗原修复，PBS冲洗，加入一抗：兔抗人Gal-3抗体（1∶2 000）或Bcl-2抗体（1∶100），恒温箱孵育2h，PBS冲洗，加入二抗、恒温箱孵育30min，PBS冲洗，DAB显色，PBS冲洗，苏木素复染，返蓝，脱水，烤干封片。用PBS代替一抗作为阴性对照，并设空白对照。

1.2.2 Gal-3与Bcl-2结果的判断标准 以细胞质或细胞核中出现明显的棕黄色颗粒为阳性细胞。光镜下半定量结果判断参照许良中等[6]的方法。染色强度分数标准：棕褐色3分，棕黄色2分，淡黄色1分，无着色0分。同样物镜下计数阳性细胞数：一个视野内着色细胞大于75%为4分；＞50%～75%为3分；＞10%～50%为2分；≤10%为1分；阴性为0分。两项得分相乘：0～2分为阴性，≥3分为阳性。

1.2.3 研究指标 观察Gal-3和Bcl-2在UC和正常大肠黏膜组织的表达，并研究二者表达与UC不同肠镜分级间及患者临床特征的关系。讨论UC大肠黏膜组织Gal-3和Bcl-2表达的关联性。

1.3 统计学处理 采用SPSS16.0统计软件进行分析，计数资料用率表示，率的比较采用χ2检验或Fisher精确概率法；采用Pearson相关分析评价UC大肠组织中Gal-3和Bcl-2表达的关联性。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 Cal-3和Bcl-2在UC和正常大肠黏膜组织的表达 Gal-3的表达位于大肠黏膜上皮细胞的细胞质，为棕黄色颗粒。Gal-3在正常大肠组织切片中均有较强的表达，分布较均匀，但在UC大肠黏膜上皮细胞的表达则显著降低，呈斑点状、不均匀，见图1、2。Gal-3在正常大肠黏膜上皮细胞的阳性表达率为100%（20／20），在UC肠黏膜上皮细胞的阳性表达率则为38.33%（23／60），两组比较差异有统计学意义（P＜0.01）。

Bcl-2表达位于大肠黏膜上皮细胞的细胞质，为棕黄色颗粒。Bcl-2在正常大肠黏膜上皮细胞中呈弱表达，主要表达于结肠隐窝基底部，而在UC大肠黏膜上皮细胞的表达明显增强，主要为固有层炎性细胞（淋巴细胞、浆细胞、中性粒细胞）的表达增强，见图3、4。Bcl-2在正常大肠黏膜上皮细胞中的阳性表达率为20.00%（4／20），而 UC的阳性表达率为88.33%（53／60），UC大肠黏膜上皮的Bcl-2表达较正常大肠黏膜上皮明显增强，两组比较差异有统计学意义（P＜0.01）。

图1 Gal-3在正常大肠上皮细胞中的表达（SP，×400）

图2 Gal-3在UC大肠上皮细胞中的表达（SP，×400）

图3 Bcl-2在正常大肠上皮细胞中的表达（SP，×400）

2.2 Gal-3和Bcl-2表达与UC不同肠镜分级间及患者临床特征的关系 Gal-3在UCⅠ级与Ⅱ级、Ⅲ级间的比较差异有统计学意义（P＜0.05），而Ⅱ级与Ⅲ级间的比较差异无统计学意义（P＞0.05）；而不同肠镜UC分级间Bcl-2的表达差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。Gal-3和Bcl-2的表达与UC患者的年龄、性别、病程均无明显相关性（P＞0.05），见表2。

图4 Bcl-2在UC大肠上皮细胞中的表达（SP，×200）

表1 Gal-3和Bcl-2表达与UC不同内镜分级间的关系[n（%）]

表2 Gal-3和Bcl-2表达与UC患者临床特征的关系

2.3 UC大肠黏膜组织Gal-3和Bcl-2表达的关联性 UC组中，Gal-3与Bcl-2共同阳性表达的有22例，共同阳性表达率为36.67%，Pearson相关分析显示两者的阳性表达程度不具有关联性（r＝0，P＞0.05）。

3 讨 论

Gal-3是半乳糖凝集素的成员之一，是半乳凝集素家族中唯一的一个具有合型结构并可抑制细胞凋亡的半乳凝集素蛋白[7]，属于半乳糖凝集素蛋白家族，广泛表达于上皮细胞和免疫细胞。Bcl-2基因位于18号染色体长臂，属于抑制凋亡基因家族中的一个重要成员，其主要通过抑制细胞凋亡来延长细胞存活时间，又被称为“生存基因”。正常结肠上皮细胞存在凋亡现象，主要发生在隐窝和绒毛顶部，意义在于调控进入隐窝及绒毛轴的细胞数量，通过清除衰老细胞来保持肠上皮的完整性，是肠上皮细胞更新的生理过程。同时，活化的炎性细胞较静息细胞更容易凋亡，正常情况下，因为肠黏膜内炎性细胞处于高的激活状态，使凋亡增加，从而维持肠黏膜微环境的免疫稳定，在细胞凋亡的基因调控网络中，Bcl-2基因家族起关键作用[8]。

Gal-3的表达部位在大肠黏膜上皮细胞的细胞质，正常大肠黏膜上皮细胞呈强表达，而在UC大肠黏膜上皮细胞的表达则明显减低，其表达阳性率与肠镜下病变程度的比较显示Gal-3的表达阳性率与UC肠镜下病变程度有关，即炎症轻的Ⅰ级组织表达高，炎症重的Ⅱ级和Ⅲ级组织表达低，但是与患者的年龄、性别、病史长短无明显相关性。Bcl-2的表达部位也在细胞质，正常大肠上皮有弱表达，主要表达于结肠隐窝基底部，保证上皮细胞增生和更新，以维持结肠黏膜屏障的动态平衡；UC患者大肠黏膜Bcl-2表达上调是对结肠黏膜上皮细胞损伤的一种反应性增生，可能与隐窝上皮细胞再生修复有关。本研究中，UC患者Bcl-2表达明显增多，与正常对照比较差异明显，主要表现为固有层炎性细胞（淋巴细胞、浆细胞和中性粒细胞）表达明显增强，提示炎性细胞凋亡明显减慢，导致UC大肠黏膜炎症的持续存在。可见，大肠黏膜活检组织中凋亡调控蛋白Gal-3和Bcl-2的异常表达在UC的发病机制中具有重要作用。

Gal-3与Bcl-2的序列相似，Gal-3含有4个与Bcl-2基因一样的氨基酸组合，而这些组合正是Bcl-2抗细胞凋亡作用的关键部位，因为它们在结构上的相似，可能在细胞凋亡中存在共同的凋亡途径[9]。国内学者庞霞等[10]研究表明在食管鳞癌组织中Gal-3与Bcl-2的表达呈正相关，两者在食管癌的发生发展中具有协同作用。但是本组资料通过关联性统计分析未能证实Gal-3与Bcl-2在UC大肠组织中的阳性表达程度具有关联性，提示两者在UC的发病中可能独立起作用，但尚需要大样本量病例进一步研究探讨。

综上所述，Gal-3和Bcl-2蛋白在UC的发病中可能独立起作用，并在发生和发展中起重要作用，可望成为UC早期诊断和预后判断的指标。

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