急性胰腺炎中E-钙粘蛋白的诊断价值

袁伟红，潘 琦△，陈国昌，陈义钢

（1.宜兴市人民医院消化科，江苏宜兴214200；2.上海交通大学医学院 200025）

急性胰腺炎（acute pancreatitis，AP）是一种具有潜在严重后果的常见疾病，尤其重症急性胰腺炎（severe acute pancreatitis，SAP）病情复杂，临床表现凶险，可导致胰外多器官的严重损伤而致功能衰竭，病死率高[1-2]。目前尚无单一的指标能在发病早期（48h内）快速、准确、方便的预测急性胰腺炎的严重程度[3]。Pittard等[4]，Sewpaul等[5]研究发现全身炎性反应和AP患者中E-钙粘蛋白（E-cadherin，E-cad）的表达明显增高，且其表达增高在疾病早期即被发现。本实验通过建立轻症胰腺炎（mild pancreatitis acute，MAP）及SAP的大鼠模型，通过分析各组E-cad表达情况，揭示E-cad在AP中的早期诊断价值。

1 材料与方法

1.1 实验动物 雄性SD大鼠24只，体质量160～180g，清洁级，购自浙江省实验动物中心，大鼠适应性饲养1周后进行造模实验。大鼠随机均分为3组：对照组、轻症急性胰腺炎组（MAP组）、重症急性胰腺炎组（SAP组）。大鼠实验前禁食12 h，通过L-精氨酸腹腔注射造模（MAP组为6%L-精氨酸，剂量1g·kg-1·次-1；SAP组为20%L-精氨酸，剂量2.5g·kg-1·次-1），共2次，间隔1h，对照组注射等量生理盐水；造模前后均自由饮水。

1.2 方法

1.2.1 主要试剂及试剂盒 L-精氨酸、戊巴比妥钠（国药化学试剂有限公司）；E-cad酶联免疫吸附剂测定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）检测试剂盒（美国GBD公司）；羊抗大鼠E-cad抗体（美国Santa Cruz公司）；ECL显像试剂盒（美国Piers公司）。

1.2.2 标本采集与检测 大鼠于成功造模24h后经2%戊巴比妥钠溶液腹腔注射麻醉（50mg／kg）。留取血清用于血淀粉酶及ELISA检测。血清淀粉酶活性采用全自动生化分析仪测定，血清E-cad表达按照ELISA说明书检测。留取大鼠的胰腺组织一部分用10%中性甲醛固定24～48h，石蜡包埋行病理切片检查，另一部分液氮冻存用于提取蛋白。

1.2.3 胰腺组织病理学评分 苏木精-伊红（HE）染色后，每张切片随机选取10个高倍镜视野，以水肿、感染、出血和坏死评价胰腺组织损伤程度。具体参考Rongione等[6]的评分标准进行病理评分，各项最低分为0分，最高分为4分，取各项评分之和为最终得分。

1.2.4 Western blot检测胰腺组织E-cad蛋白水平改变 考马斯亮蓝染色测定提取胰腺组织蛋白样品浓度并调整各上样量至30μg，加入2×上样缓冲液，煮沸5min后取上清液在制备好的10%的十二烷基-聚丙烯酰胺凝胶电脉（SDS-PAGE）上（每份样品按顺序加至2个孔中）行垂直电泳分离。硝酸纤维素膜电转移印迹。以含5%脱脂奶粉封闭，而后将膜从正中剪开，一部分加入羊抗大鼠E-cad抗体（1∶1 000稀释），再以辣根过氧化物酶耦联兔抗羊IgG抗体（1∶2 000稀释）孵育；另外一部分加入小鼠抗大鼠β-actin（1∶1 000稀释），再以辣根过氧化物酶耦联山羊抗小鼠IgG抗体（1∶4 000稀释）孵育，以上各步骤间用PBS-T常温下充分洗膜，最后用增强化学发光法（ECL）显色。

1.3 统计学处理 采用SPSS16.0统计软件进行分析，计量资料以±s表示，采用ANOVA单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 胰腺等组织大体形态及病理学改变 SAP组大鼠胰腺组织出血坏死，部分见血性腹水，光镜示胰腺小叶轮廓破坏，间质水肿，中性粒细胞和单核细胞浸润；MAP组可见胰腺肿大，胰腺周围少量脂肪坏死，光镜下可见部分胰腺组织明显小叶间水肿，少量炎性细胞浸润，未见出血和腺泡细胞坏死；对照组大鼠腹腔无渗出，胰腺无水肿，病理切片光镜下无明显改变。病理评分：MAP组（6.75±2.12）分和SAP组（10.38±0.56）分明显高于对照组（1.75±0.16）分，差异有统计学意义（P＜0.05），且SAP组与 MAP组比较，SAP组高于 MAP组（P＜0.05），见表1。

表1 各组胰腺病理评分、血清淀粉酶和E-cad比较情况（±s，n＝8）

表1 各组胰腺病理评分、血清淀粉酶和E-cad比较情况（±s，n＝8）

a：P＜0.05，与对照组比较；b：P＜0.05，与 MAP组比较。

组别 胰腺病理评分（分） 血清淀粉酶（U／L） E-cad（pg／mL）1.75±0.16 301.75±26.89 626.50±72.12 MAP组 6.75±2.12a 1 003.83±111.52a1 025.50±131.33a SAP组 10.38±0.56ab 1 497.29±319.57ab 1 561.75±144.82对照组ab

2.2 血清淀粉酶和E-cad表达水平 全自动生化分析仪检测显示：血清淀粉酶值MAP组和SAP组明显高于对照组，且SAP组与MAP组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。ELISA检测血清E-cad结果显示MAP组和SAP组均明显高于对照组，且SAP组与 MAP组比较差异也有统计学意义（P＜0.05），见表1。

2.3 Western blot检测胰腺组织中E-cad蛋白的表达 与预染蛋白Mark相对比，β-actin和E-cad特异性免疫印迹条带的相对分子量分别为43×103和120×103（图1）。经电脑扫膜其灰度示，SAP组E-cad表达明显强于对照组及MAP组。

3 讨 论

AP系多种病因导致胰酶在胰腺内被激活后消化自身胰腺及其周围组织所引起的化学性炎性反应[7]；临床症状轻重不一，轻者有胰腺水肿，重者胰腺发生坏死或出血，可出现休克和腹膜炎甚至多器官功能障碍，病情凶险，病死率高[8]。近年来AP的发病率呈增长趋势，虽然积极采取各种治疗方法，但病死率仍高达20%～30%[1]。由于血清淀粉酶高低不一定反映病情轻重，临床胰腺病理取材困难等原因，AP的早期诊断、早期治疗及疾病严重程度的早期判断仍然是亟待解决的难题。

由于发病因素较复杂，目前AP确切的发病机制尚未完全阐明。Rinderknecht等[9]提出的白细胞过度激活假说受到普遍的认可，该假说认为异常激活的胰酶在造成胰腺损伤的同时，激活了胰腺内的炎症细胞，使其释放炎症介质，而这些介质进入血液循环激活了机体其他组织的炎症细胞，进一步释放大量的炎症介质而产生一系列连锁反应促成全身炎性反应综合征和多器官功能障碍综合征[10]。E-cad是一个相对分子量为120×103的钙依赖性细胞黏附分子，介导上皮细胞间黏附的跨膜糖蛋白，在细胞外钙离子参与下介导同种亲和性细胞间的黏附[11]；E-cad的异常表达，导致细胞易去分化，细胞间连接松散，易于脱落，并进一步诱导血管炎症细胞因子等生成，促进趋化因子转移[12-13]。Pittard等[4]研究发现全身炎性反应综合征患者可溶性E-cad的表达水平显著增高，更为重要的是，可溶性E-cad显著增高在炎性反应早期即被发现。

本研究参照Czakó等[14]的急性胰腺炎造模方法的，腹腔注射L-精氨酸建立AP的大鼠模型，检测血清淀粉酶值和胰腺病理，结果显示MAP组和SAP组血清淀粉酶值和胰腺病理评分均较对照组明显增高，差异有统计学意义，证实造模成功。E-cad的ELISA检测结果及Western blot检测胰腺组织中E-cad蛋白的表达都显示SAP组E-cad的含量显著高于MAP组，且两者都显著高于对照组，提示急性胰腺炎早期（本实验设定为24h）E-cad蛋白高表达，与Sewpaul等[5]有类似的结果，提示E-cad在AP早期具有一定的诊断价值，可能是判断AP严重程度的一个早期客观指标[15]。本研究为了与现阶段急性胰腺炎诊断的实验室“金标准”——血清淀粉酶比较，选取了造模后24h为采样时间。其更确切的临床诊断价值尚需多个时间点的对照和临床大样本多中心的统计学分析。

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