禽I型副粘病毒天鹅源分离株对鸡的致病性研究

赵莎莎，韩宗玺，邵昱昊，孔宪刚，刘胜旺

(中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 兽医生物技术国家重点实验室/禽呼吸道病创新团队，黑龙江 哈尔滨 150001)

禽I 型副粘病毒(Avian paramyxovirus serotype 1，APMV-1)是危害养禽业主要的传染病之一，宿主范围广泛，除家禽外，在实验室或自然条件下该病毒至少可以感染241 种鸟类[1]。近年来，从其他禽类，如鸽、企鹅、鹅、孔雀等宿主中分离到APMV-1 的报道逐渐增多[2]，有研究表明从水禽中分离的弱毒进入家禽体系经传代后毒力有增强的趋势[3]。通常鸽源APMV-1 对鸡没有致病性，但在鸡体传代后则会表现出对鸡的致病性[4]，因此研究其它宿主来源的病毒株对鸡的致病状况具有重要的意义。APMV-1 的基因组为单股负链不分节段的RNA 病毒，长度约为15 200 nt，主要编码6 种结构蛋白：核衣壳蛋白(NP)、磷蛋白(P)、基质蛋白(M)、融合蛋白(F)、血凝素-神经氨酸酶蛋白(HN)、以及RNA 依赖的RNA 聚合酶蛋白(L)。其中在P 基因转录过程中还会出现RNA 编辑现象，编码另外两种额外的蛋白质(V 蛋白和W 蛋白)[5]，其中L 属于最保守的基因。

本研究于2012 年从黑龙江省发病天鹅群体中分离到一株APMV-1，该病毒株在天鹅群体中能够引起80 %的发病率和20 %的死亡率。为研究其对鸡的致病性，将该分离株感染SPF 鸡，鉴定发病率、死亡率及组织分布，同时检测其刺激鸡体产生的抗体水平变化。

1 材料和方法

1.1 病毒株及实验动物 天鹅源病毒株sw/CH/LHLJ/120608 由本实验室分离鉴定；9 日龄～11 日龄的SPF 鸡胚、SPF 鸡及鸡血均由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物中心提供。

1.2 主要试剂 RNAiso Plus 试剂、一步法PCR 试剂盒PrimeScriptTMOne Step RT-PCR Kit、pMD18-T载体和荧光定量试剂盒One Step PrimeScript®RTPCR Kit 均购自宝生物工程(大连)有限公司；胶回收纯化试剂盒购自美国OMEGA 公司。

1.3 病毒的滴定 采用血凝(HA)及血凝抑制试验(HI)对病毒进行滴定。另外，将病毒感染后的鸡胚尿囊液采用PBS 作10 倍的系列稀释，10-6～10-10每个稀释度接种5 枚9 日龄的SPF 鸡胚(0.1 mL/胚)，记录每个鸡胚的死亡时间，按Reed-Muench 法计算该病毒株的EID50。

1.4 动物感染试验 将60 只2 日龄的SPF 鸡平均分为两组，一组以点眼和滴鼻的方式感染105EID50/只(体积为100 μL)的sw/CH/LHLJ/120608，另一组作为阴性对照。并于感染后的5 d～25 d 内每5 d 分别迫杀3 只，采集19 个脏器。并且于感染后定期对其中的10 只鸡进行翅下静脉采血，用HI 检测抗体水平的动态变化。

1.5 荧光定量RT-PCR(qRT-PCR)对组织样品中病毒载量的监测 按照文献[6]建立的qRT-PCR 方法，针对APMV-1 保守的L 基因合成引物和探针，利用RNAiso 提取采集组织样品的总RNA，经qRT-PCR 检测组织中的病毒载量(反应体系参照试剂盒)，反应程序为：42 ℃5 min、92 ℃10 s；95 ℃5 s、50 ℃20 s，共40 个循环。运行结束后，根据动力学曲线计算出各组织样品中的病毒拷贝数。

2 结果与讨论

2.1 病毒的滴定 采用HA 和HI 试验对该分离株进行滴定，其HA 效价为27，HI 效价为28。该病毒株的EID50按照Reed-Muench 法计算结果为10-8.67。

2.2 动物感染试验

2.2.1 感染鸡的发病率和死亡率 SPF 鸡感染该分离株后，30 %(9/30)的SPF 鸡表现出精神沉郁、呼吸急促、翅膀下垂等临床症状，并且发生6 %(2/30)的死亡率。将死亡的鸡进行剖检，发现气管内有粘液，十二指肠和盲肠扁桃体出血等症状。而对照组的鸡没有任何临床症状和剖检病变。

2.2.2 各组织中的病毒载量检测 采用qRT-PCR 方法检测组织样品中的病毒载量。结果显示，在感染后的5 d 和10 d，呼吸系统、消化道系统、免疫系统及泌尿系统的各组织均能够检测到sw/CH/LHLJ/120608，并且病毒在各组织中具有较高的拷贝数(107～1012)(图1)。于感染后的15 d 和20 d，3 个组织，即小肠、盲肠扁桃体和法氏囊，能够检测到该分离株，而感染后的25 d，所有组织均未检测到病毒。

根据对APMV-1 实验动物感染的判定标准，弱毒通常引起轻微的或不明显的消化道和呼吸道症状，需要呼吸道或肠道中胰酶样蛋白酶的参与才能感染细胞，因此弱毒仅局限在呼吸道和胃肠道的粘膜表面[7]；中等毒力引起急性的呼吸道症状，能够被细胞内广泛存在的蛋白酶作用[8]，因此在体内呈现系统性地分布，并伴随着较低的死亡率(通常小于10 %)；而强毒引起急性的全身性感染，死亡率高达100 %[9]。该分离株能够在感染的SPF 鸡群中引起30 %的发病率和6 %的死亡率，另外，qRT-PCR 的结果表明，病毒在鸡体的呼吸系统、消化系统、免疫系统和泌尿系统等组织中广泛存在。综上表明sw/CH/LHLJ/120608 在对SPF 鸡的感染试验中，表现出中等毒力的致病力特征。

2.2.3 抗体水平的监测 采用HI 监测感染后10 只鸡的抗体水平变化，在第4 d，10 只鸡的抗体均出现阳转，在22～24内变动，然后HI 效价逐渐上升到28。将该分离株的抗体水平变化与La Sota 株在鸡体的抗体作比较时，发现sw/CH/LHLJ/120608 在鸡体内的抗体阳转时间早于La Sota 株，并且在监测的各时间点，其抗体水平均高于La Sota 株，表明天鹅源病毒株在鸡体内仍能够保持良好的免疫原性，引起较好的体液免疫(图2)。

图1 病毒在感染鸡各组织中的载量Fig.1 Viral loads in the tissues of chickens infected with sw/CH/LHLJ/120608

图2 抗体水平变化Fig.2 Dynamics of the antibody titers in artificially infected chicks induced by APMV-1s

sw/CH/LHLJ/120608 分离于发病的天鹅群体，该群体具有喘气、咳嗽、打喷嚏等严重的呼吸道症状，并伴随着80 %的发病率和20 %的死亡率，表明该分离株对天鹅具有致病性。而sw/CH/LHLJ/120608 在对SPF 鸡的感染试验中，表现出中等毒力的致病力特征，并且具有良好的免疫原性。

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