三种泵用胰岛素体外对抗等电点沉淀的研究

汤智慧，金杨红，母义明，崔晓飞，李久旭，梁 潇，李 芳



三种泵用胰岛素体外对抗等电点沉淀的研究

汤智慧1ab，金杨红2，母义明1a*，崔晓飞3，李久旭1b，梁 潇1b，李 芳1b

目的 比较三种市售泵用胰岛素对抗等电点沉淀的效果。方法 通过加入稀释盐酸的方法模拟pH值下降过程中，用高效液相色谱(HPLC)测定三种胰岛素(重和林R、诺和灵R、优泌林R)等电点沉淀情况。并采用高斯拟合的方法绘制出沉淀曲线，并得出三种胰岛素发生沉淀时的pH值。结果 重和林R、诺和灵R和优泌林R在出现10%和90%沉淀时的pH值分别为6.52和5.82，6.85和6.00，6.68和5.94。结论 重和林R开始出现沉淀的pH值最低，对抗等电点的作用最强，其次是优泌林R，诺和灵R最差。胰岛素等电点会引起胰岛素构象改变发生沉淀，阻塞胰岛素泵，进而引起血糖控制不佳。但本研究仅在体外比较了胰岛素对抗等电点沉淀的不同，与临床中胰岛素泵堵塞之间作用的机制仍需进一步研究。

胰岛素泵；等电点沉淀;高效液相色谱法

0 引言

早在上世纪七八十年代，胰岛素持续皮下泵入(CSII)作为一种治疗手段就开始在临床使用。由于CSII对平均血糖水平和糖化血红蛋白(HbA1c)的改善较静脉注射胰岛素均有明显提高，可以明显改善糖尿病患者的生活质量，近年来发展迅速。但在CSII治疗过程中，胰岛素储存在储药器中，因此，环境的改变(如：pH值的改变、温度的升高等)可能会影响胰岛素的稳定性，引起胰岛素构象的改变以及性质变化，造成胰岛素沉淀进而导致胰岛素泵管路的堵塞[1-2]。胰岛素泵的堵塞是CSII治疗糖尿病的主要缺点，会增加患者出现糖尿病酸中毒的风险[3]。尽管随着胰岛素泵技术的提高以及胰岛素制剂配方的改变，胰岛素泵管路堵塞问题引起的糖尿病酮症酸中毒已经大大减少，但仍然是CSII临床治疗面临的一个问题。因此，减少胰岛素泵的堵塞无疑可以给患者带来更大的获益。本研究旨在通过体外模拟pH值下降过程中三种短效胰岛素发生等电点沉淀的情况。

1 仪器和试药

1.1 仪器 高效液相色谱仪(安捷伦，1100)，安捷伦色谱工作站(美国安捷伦公司)，电子天平(METTLER TOLEDO XS205DU)，pH计(METTLER TOLEDO FIVEEASY电极FE20)，涡旋振荡器[IKA(r)VORTER GENIUS3]，离心机(SIGMA 2-16PK)。

1.2 试药 赖脯胰岛素对照品(批号：140729-200501，含量94.4%，效价26.9 IU/mg)，重组人胰岛素注射液(商品名：重和林R，拜耳，批号：643005)，重组人胰岛素注射液(商品名：优泌林R，礼来，批号：C256635E)，生物合成人胰岛素注射液(商品名：诺和灵R，诺和诺德，批号：DVG0145)，乙腈(色谱纯)，盐酸(优级纯，北京化工，批号：20140401)。

2 方法和结果

2.1 色谱条件[4]根据《中国药典》(2010版第一增补版)，色谱柱：安捷伦十八烷基硅胶柱(ZORBAX SB-C18，4.6×250 mm，5 μm)；流动相：0.2 mol/L硫酸盐缓冲液(取无水硫酸钠28.4 g，加水溶解后，加磷酸2.7 mL，乙醇胺调节pH值至2.3，加水1 000 mL)-乙腈(74∶26)；柱温：40 ℃；进样量：10 μL；检测波长：214 nm。

2.2 胰岛素沉淀的制备 将每种胰岛素分为36等份，每份5 mL。通过加入100%浓度为0.1 mol/L的盐酸和100%纯净的蒸馏水不同比例的混合(总量720 μL)，来调整每个样本的pH值，使得所有的pH覆盖7.1～3.6(胰岛素的沉淀范围)，使用pH计测定pH值，将样本室温下放置涡旋振荡器上振荡1 h。将振荡沉淀后的样品放入离心机(4 000 r/min)中离心5 min。精密量取离心后样品的上清液10 μL，注入HPLC仪，记录色谱柱。另外取对照品3份加入720 μL蒸馏水，同法测得。按照外标法以胰岛素的峰面积来计算溶解胰岛素的含量。根据3种胰岛素上清液中溶解胰岛素的量以及对照品中胰岛素含量(n=3)来确定3种胰岛素在不同pH值下的沉淀量。

2.3 统计学方法[5]根据改进的高斯模型，将沉淀的胰岛素的百分比与pH值和进行拟合。统计分析采用SAS 9.2软件。公式如下：

2.4 结果 pH值影响胰岛素沉淀量，本研究显示，pH 7.0～3.6覆盖了3种胰岛素从开始沉淀到沉淀完全的pH范围。3种胰岛素沉淀量与pH值的关系见图1～图3。结果显示，当pH值下降时，三种胰岛素开始出现沉淀的pH值是不同的，重和林R<诺和灵R<优泌林R。见表1、图4。

表1 根据高斯方程拟合结果推算出不同沉淀量所对应的pH值

注：*5 mL胰岛素加入720 μL蒸馏水后的pH值(每种胰岛素各取3份取平均值)

图1 重和林R沉淀比例与pH值之间的关系拟合曲线

图2 诺和灵R沉淀比例与pH值之间的关系拟合曲线

图3 优泌林R沉淀比例与pH值之间的关系拟合曲线

图4 三种胰岛素在pH下降过程中对抗等电点沉淀的比较

3 讨论

随着胰岛素泵技术的提高，理论上认为在管路中不会发生胰岛素等电点沉淀。但根据文献报道，在使用胰岛素泵给药过程中，pH值会发生微小的降低(即储药器中pH为7.4，导管末端pH为7.2)，提示pH值变化主要发生在输注部位[1-2]。另外，由于胰岛素等电点沉淀引起的胰岛素泵管路堵塞的报道均是使用无缓冲盐的胰岛素，以及血管内的CO2扩散到到管中引起管路中pH值从7.0降到5.8引起的[5]。所以，即使泵技术提高了，胰岛素等电点沉淀仍然可能发生，实际临床中pH值降低会在组织中发生，如人体脓肿组织中pH值范围是4.7～7.2,局部细菌感染部位pH值也会下降等[5]。

如表1所示，重和林R、诺和灵R、优泌林R在出现10%和90%沉淀时的pH值分别为6.52和5.82、6.85和6.00、6.68和5.94。因此，胰岛素在溶液中由中性到酸性的过程中，诺和灵R最早形成沉淀，而重和林R在pH<5.9以后才会形成沉淀，其形成沉淀最晚，说明重和林是由中性到酸性环境中最稳定的胰岛素，其对抗胰岛素等电点沉淀的效果最强。

胰岛素等电点会引起胰岛素构象改变，进而发生沉淀，阻塞胰岛素泵，引起血糖控制不佳。但本研究仅在体外比较了胰岛素对抗等电点沉淀的不同，与临床中胰岛素泵堵塞之间的因果关系以及胰岛素泵发生管路堵塞的机制仍需进一步研究。

[1] Kerr D,Wizemann E,Senstius J,et al.Stability and performance of rapid-acting insulin analogs used for continuous subcutaneous insulin infusion:a systematic review[J].J Diabetes Sci Technol,2013,7(6):1595-1606.

[2] Bode BW.Comparison of pharmacokinetic properties,physicochemical stability,and pump compatibility of 3 rapid-acting insulin analogues-aspart,lispro,and glulisine[J].Endocr Pract,2011,17(2):271-280.

[3] Naik S,Kerr D,Begley J,et al.Influence of local skin temperature and choice of insulin analog on catheter occlusion rates during continuous insulin infusion:an exploratory study[J].Diabetes Technol Ther,2012,14(11):1018-1022.

[4] 国家药典委员会.中华人民共和国药典(二部)[S].北京:化学工业出版社,2010:469-470.

[5] Poulsen C,Langkjaer L,Worsφe C,et al.Precipitation of insulin products used for continuous subcutaneous insulin infusion[J].Diabetes Technol Ther,2005,7(1):142-150.

Invitrostudy on resistance towards isoelectric precipitation of insulin products used for continuous subcutaneous insulin infusion

TANG Zhi-hui1ab,JIN Yang-hong2,MU Yi-ming1a*,CUI Xiao-fei3,LI Jiu-xu1b,LIANG Xiao1b,LI Fang1b

(1.a.Deptment of Endocrinology,b.Department of Pharmaceutical Care,Chinese PLA General Hospital,Beijing 100853,China;2.Puyang Oil Field General Hospital，Henan 457001，China；3.Institute for Drug and Instrument Control of PLA,Beijing 100071，China)

Objective To compare the resistance towards isoelectric precipitation of three insulin products used for continuous subcutaneous insulin infusion.Methods The degree of isoelectric insulin precipitation of recombinant human insulin injection(SciLin R),Biosynthetic human insulin injection (Novolin R),and recombinant human insulin injection (Humulin R) was examined by HPLC in the simulation of reducing pH with addition of diluted HCl.The modified Gaussian model was used to superimpose the percentage of precipitated insulin versus pH.Results The pH value at the time point of 10% and 90% precipitation occurred was 6.52 and 5.82 for SciLin R,6.85 and 6.00 for Novolin R,6.68 and 5.94 for Humulin R. Conclusion Resistance towards isoelectric precipitation is highest for SciLin R,while the pH value when the precipitation occurred is lowest. The resistance towards isoelectric precipitation of Novolin R is lowest. Isoelectric precipitation can alter the pharmacokinetic properties of the insulin and lead to the occlusion of the infusion catheter,result in poor control of blood sugar. The article compared the differences in resistance towards isoelectric precipitation of different insulin products,and the mechanism in the resistance and the formulation of catheter occlusion requirefurther studies.

Continuous subcutaneous insulin infusion (CSII);Isoelectric precipitation;HPLC

2015-02-25

1.解放军总医院a.内分泌科，b.药品保障中心，北京 100853；2.河南濮阳市油田总医院药剂科，河南 濮阳 457001；3.总后勤部卫生部药品仪器检验所，北京 100071

*通信作者

10.14053/j.cnki.ppcr.201511024