野甘草醇对胸腺激酶依赖的更昔洛韦在前列腺癌裸鼠体内的增效作用

杨彩云，薛文勇*，齐进春，杨　涛，杜　蕾，贾江华(.河北医科大学第二医院泌尿外科，河北 石家庄 050000;.河北省人民医院泌尿外科，河北 石家庄 05005)



·论著·

野甘草醇对胸腺激酶依赖的更昔洛韦在前列腺癌裸鼠体内的增效作用

杨彩云1，薛文勇1*，齐进春1，杨涛2，杜蕾1，贾江华1(1.河北医科大学第二医院泌尿外科，河北 石家庄 050000;2.河北省人民医院泌尿外科，河北 石家庄 050051)

[摘要]目的观察野甘草醇(scopadulciol,SDC)在人端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)启动子调控腺病毒介导的单纯疱疹病毒胸苷激酶基因/更昔洛韦(herpes simplex virus thymidine kinase/ganciclovir,HSV-tk/GCV)自杀基因系统在前列腺癌裸鼠体内细胞自杀作用中的增效作用。方法建立前列腺癌裸鼠移植瘤模型，将不同配伍浓度的SDC、腺病毒-人端粒酶逆转录酶启动子-单纯疱疹病毒-胸苷激酶基因(Ad-hTERT-HSV-tk)、GCV应用于荷瘤裸鼠，观察肿瘤体积、肿瘤质量、肿瘤抑制率。结果A、B、C、D 4组肿瘤体积和肿瘤质量均明显小于E、F、G、H组，加入SDC的A、B、C 3个治疗组肿瘤体积和肿瘤质量均明显小于未加入SDC的D组(P<0.01)。A、B、C、D 4组肿瘤抑制率明显小于E、F、G组，加入SDC的A、B、C 肿瘤抑制率明显小于D组(P<0.01)。结论通过裸鼠体内实验证实SDC对胸腺激酶依赖的GCV阻断前列腺癌进展有一定的增效作用。

[关键词]前列腺肿瘤；野甘草醇；小鼠

doi:10.3969/j.issn.1007-3205.2015.12.009

在人体内胸苷激酶 (thymidine kinase,TK)能够将更昔洛韦(ganciclovir,GCV)最终代谢为3磷酸GCV，从而能够杀伤肿瘤细胞，我们从野甘草分离得到的一种四环的二萜类化合物野甘草醇(scopadulciol,SDC)能显著提高TK激酶的活性，3磷酸GCV浓度相应增加，从而加强了TK/GCV系统对肿瘤的杀伤作用[1-2]。本研究重组具有肿瘤靶向性的腺病毒-人端粒酶逆转录酶启动子-单纯疱疹病毒胸苷激酶基因(Ad-hTERT-HSV-tk)，同时将SDC应用于Ad-hTERT-HSV-tk/GCV基因系统，通过对前列腺癌的荷瘤裸鼠模型体内实验研究，探讨 SDC对TK依赖的GCV在前列腺肿瘤基因治疗中增效作用。

1材料与方法

1.1实验动物与试剂4～6周龄BALB/C裸鼠80只(雌雄各半，体质量18～22 g)由中国医学科学院动物培育中心提供。人前列腺癌 LNCaP细胞株由协和医科大学基础医学部细胞中心提供，具有前列腺癌靶向性的重组腺病毒Ad-hTERT-HSV-tk由我科构建，浓度滴度为1×1011pfu/mL，-80 ℃保存，RPMI 1640培养液购自美国Invitrogen公司，GCV购于Roche-Syntax公司，SDC由河北医科大学药学院药理学教研室协助提取。

1.2模型制备及分组以4×106LNCaP细胞悬液建立前列腺癌裸鼠(BALAB/C)皮下移植瘤模型，2 d后所有裸鼠左前背部皮下均可见移植瘤形成，5 d后肿瘤直径长至4～5 mm。待成瘤约0.5 cm3(肿瘤体积按公式计算:体积=长径×短径2×π/6) 后，将荷瘤小鼠分为8组，每组10只，共80只。A组:治疗1组，肿瘤局部注射1.0×109pfu/mL Ad-hTERT-HSV-tk 0.1 mL,第1、7、13天各1次，第2～18天腹腔注射GCV 50 mg/d、SDC 1 mg/d；B组:治疗2组，肿瘤局部注射5.0×109pfu/mL Ad-hTERT-HSV-tk 0.1 mL,第1、7、13天各1次，第2～18天腹腔注射GCV 50 mg/d、SDC 1 mg/d；C组:治疗3组，肿瘤局部注射1.0×1010pfu/mL Ad-hTERT-HSV-tk 0.1 mL,第1、7、13天各1次，第2～18天腹腔注射GCV 50 mg/d、SDC 1 mg/d；D组：Ad-hTERT-HSV-tk、SDC对照组，肿瘤局部注射5.0×109pfu/mL Ad-hTERT-HSV-tk 0.1 mL,第1、7、13天各1次，第2～18天腹腔注射GCV 50 mg/d；E组：GCV对照组，肿瘤局部注射生理盐水0.1 mL,第2～18天腹腔注射GCV 50 mg/d；F组：GCV、SDC对照组，肿瘤局部注射生理盐水0.1 mL,第2～18天腹腔注射GCV 50 mg/d、SDC 1 mg/d；G组:Ad-hTERT-HSV-tk对照组肿瘤局部注射5.0×109pfu/mL Ad-hTERT-HSV-tk 0.1 mL,第1、7、13天各1次,第2～18天腹腔注射生理盐水；H组：空白对照组不给药。

1.3观察指标各组动物从注射腺病毒开始，6周后采用颈椎脱臼法处死，取出肿瘤称质量并进行相关指标检测。通过直接测量移植瘤体积、肿瘤质量，计算肿瘤抑制率=(1-治疗组瘤质量/空白对照组瘤质量)×100%[2]，从宏观上证明Ad-hTERT-HSV-tk、GCV、SDC的治疗作用。

2结果

实验开始后，8个实验组的肿瘤均呈持续快速生长，A、B、C、D4组肿瘤体积和肿瘤质量均明显小于E、F、G、H组，加入SDC的A、B、C3个治疗组 肿瘤体积和肿瘤质量均明显小于未加入SDC的D组，差异有统计学意义(P<0.05)。A、B、C、D4组肿瘤抑制率明显小于E、F、G组，加入SDC的A、B、C肿瘤抑制率明显小于D组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1各组裸鼠移植瘤生长的抑制效应

Table1Curativeeffectoftransplanted

tumorofdifferentgroups

组别肿瘤体积(mm3)肿瘤质量(g)肿瘤生长抑制率(%)A组262.73±2.42*#0.71±0.02*#72.96±0.90*#B组243.82±2.74*#0.65±0.02*#75.29±0.75*#C组232.85±1.92*#0.62±0.02*#76.24±0.75*#D组312.06±3.80*0.84±0.02*68.06±0.90*E组950.15±8.212.46±0.026.50±1.13F组967.15±6.772.55±0.023.03±1.49G组947.30±15.722.45±0.036.84±1.01H组976.26±10.632.63±0.02- F21951.19019341.93815233.919P0.0000.0000.000

*P<0.01与E、F、G、H组比较#P<0.01与D组比较(q检验)

3讨论

前期实验重建了具有肿瘤特异性的重组腺病毒Ad-hTERT-HSV-tk，并通过细胞实验以及裸鼠体内实验进一步证实重组腺病毒Ad-hTERT-HSV-tk结合药物前体GCV能够靶向性杀伤人前列腺癌以及膀胱癌细胞，显著减缓或缩小人前列腺癌以及膀胱癌荷瘤裸鼠的肿瘤体积[3-5]。

重组腺病毒Ad-hTERT-HSV-tk的靶向性体现在应用于前列腺癌后，HSV-tk基因仅在肿瘤细胞表达，靶向性杀伤肿瘤细胞，而在正常细胞中检测不到HSV-tk基因表达，GCV的活化产物3磷酸GCV能够精准杀伤肿瘤细胞，人体正常组织几乎不受影响[6-7]。朱艳培等[8]将HSV-tk/GCV基因系统成功应用于人肝癌细胞治疗，并进一步研究了其作用机制。国内外学者考虑通过增加旁杀伤效应来提高基因治疗的效果，这样不仅能够弥补重组腺病毒转染肿瘤细胞效率低的不足，更重要的是还能保证治疗基因Ad-hTERT-HSV-tk和GCV的安全注射剂量，增加疗效的同时又提高了治疗系统的安全性[9-13]。有学者通过研究发现SDC能显著提高TK的活性，从而加强了TK/GCV系统对肿瘤的杀伤作用[1-2，14]。那么，药物前体GCV与提高其3磷酸代谢产物水平的TK酶活化剂SDC的联合应用，能否提高对肿瘤细胞的杀伤效应，该问题的解决将有助于肿瘤的基因治疗。

本研究将Ad-hTERT-HSV-tk/GCV/SDC基因治疗系统应用于前列腺癌，结果显示SDC对 Ad-hTERT-HSV-tk联合GCV治疗人前列腺癌裸鼠移植瘤的生长抑制有明显增强作用；4个治疗组的肿瘤体积、肿瘤质量均明显低于其他几个对照组，并且加入SDC的治疗组的肿瘤体积、肿瘤质量均明显低于不加SDC的D组；4个治疗组的肿瘤生长抑制率均明显高于其他组，并且加入SDC的治疗组明显高于不加SDC的D组。表明Ad-hTERT-HSV-tk/GCV对裸鼠前列腺癌移植瘤有明显的治疗作用，加入SDC后可以显著增加该系统对前列腺癌的抑制作用。

综上所述，在裸鼠体内SDC对TK依赖的GCV阻断前列腺癌进展有一定的增效作用，将天然药物SDC与具有肿瘤靶向性的重组腺病毒Ad-hTERT-HSV-tk以及药物前体GCV联合应用可达到增效减毒的目的，并为开发治疗晚期特别是伴有远处转移前列腺癌的生物药物奠定了基础。

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(本文编辑：赵丽洁)

Synergistic effect of scopadulciol in treatment of human prostate cancer in vitro by thymidine kinase-dependent ganciclovir

YANG Cai-yun1,XUE Wen-yong1*,QI Jin-chun1,YANG Tao2,DU Lei1,JIA Jiang-hua1

(1.Department of Urology,the Second Hospital of Hebei Medical University,Shijiazhuang 050000,China;2.Department of Urology,the People's Hospital of Hebei Province,Shijiazhuang 05005,China)

[Abstract]ObjectiveTo investigate the synergistic effect of scopadulciol(SDC) on the killing effect on antitumor actions by Ad-hTERT-HSV-tk/GCV suicide gene system on prostate cancer cells in vitro.MethodsWe successfully built the model of human prostate cancer xenografts in BALB/C nude mouse.The BALB/C nude mice were treated respectively with Ad-hTERT-HSV-tk or GCV in combination with SDC in different doses and different concentrations.The indexes of tumor volume,tumor mass,relative tumor curative effect were evaluated.ResultsThe growth rate of tumor volume of four treatment groups could be significantly inhibited after treatment.The tumor volume and tumor mass of group A,group B,group C and group D were significantly lower than the other groups(P<0.01).The relative tumor curative effect of group A,group B,and group C,which were added SDC,were significantly higher than that of group D(P<0.01).ConclusionThe synergistic effect of SDC was significantly shown in treatment of human prostate cancer cells by TK-dependent GCV.

[Key words]prostatic neoplasms;scopadulciol；mice

[中图分类号]R737.25

[文献标志码]A

[文章编号]1007-3205(2015)12-1397-03

[作者简介]杨彩云(1974-)，女，河北元氏人，河北医科大学第二医院主管护师，医学学士，从事临床护理学研究。*通讯作者。E-mail:qjcbaby333@163.com

[基金项目]河北省自然基金资助项目(H2014206047)

[收稿日期]2015-08-17；[修回日期]2015-10-12