胶体金法和质谱法检测禽蛋中喹诺酮类残留的比较

柳爱春，刘 超，赵 芸，陈青舟，张宣伟

（1.杭州市农业科学研究院，浙江杭州 310024；2.杭州南开日新生物技术有限公司，浙江杭州 310022）

胶体金法和质谱法检测禽蛋中喹诺酮类残留的比较

柳爱春1，刘 超1，赵 芸1，陈青舟2，张宣伟2

（1.杭州市农业科学研究院，浙江杭州 310024；2.杭州南开日新生物技术有限公司，浙江杭州 310022）

分别采用多克隆抗体（多抗）和单克隆抗体（单抗）制备检测喹诺酮类药物的免疫胶体金试剂盒检测杭州地区市售禽蛋样品128份，用多抗试剂盒检出24份阳性样品（占总样品量的18.8%），其中14份为强阳性样品（占总样品量的10.9%）；用单抗试剂盒检出42份阳性样品（占总样品量的32.8%），其中24份为强阳性样品（占总样品量的18.8%）。所有样品再用液相⁃串联质谱（LC⁃MS／MS）法检测氟甲喹、诺氟沙星、依诺沙星等12种喹诺酮类药物残留量，检测结果为喹诺酮类残留总量＞100μg·kg－1的样品14份、20～100μg·kg－1的样品10份、2.0～20μg·kg－1的样品16份、0.2～2.0μg·kg－1的样品16份，2种不同的免疫胶体金试剂盒快速检测结果与质谱法的符合率分别为100%和95%。试验表明，胶体金法和质谱法各有优势且结果符合性好。

喹诺酮类药物；禽蛋；胶体金法；快速检测

喹诺酮类（Quinolones，QNs）是一类化学合成的抗菌药，由于这类药物高效低毒、价格低廉，少量使用还有一定的促生长作用，因此近年来被广泛应用于畜禽、水产养殖中预防、治疗疾病。但是在长期使用过程中，人们逐渐发现该类药物在动物体内消除缓慢，过量或不当使用会造成动物产品中的残留和蓄积。人体摄入后，除了可能会引起关节病变、消化道反应、肝肾毒性、血液系统毒性等不良反应外，长期食用含低剂量抗生素，还导致产生耐药性［1］，甚至产生超级细菌［2］，从而不利于该类药物对人类疾病的治疗。在农业部235号公告中，规定产蛋鸡禁用恩诺沙星。到目前为止，鸡蛋中药物残留的检测方法报道较少，大多数是在动物组织残留检测方法的基础上进行改进的，这也是鸡蛋中兽药残留控制的一大问题。因此，寻找高灵敏度、简单、快速、低成本的检测方法是解决兽药残留的关键所在。

1 材料与方法

1.1 材料及仪器

1.1.1 材料

禽蛋样品。购自杭州市区多家超市和农贸市场的鸡蛋114份、鸭蛋5份、鹌鹑蛋4份、鸽子蛋4份、鹧鸪蛋1份。

1.1.2 试剂

喹诺酮多克隆抗体免疫胶体金试剂盒（多抗试剂盒）和单克隆抗体免疫胶体金试剂盒（单抗试剂盒）系实验室自制，含免疫胶体金试剂板、复溶液和小滴管；12种氟喹诺酮标准物质：氟甲喹Flumequine（简写Flu）、诺氟沙星Norfloxacin（简写Nor）、依诺沙星Enoxacin（简写Eno）、环丙沙星Ciprofloxacin（简写Cip）、培氟沙星Pefloxacin（简写Pef）、洛美沙星Lomefloxacin（简写Lom）、丹诺沙星（达氟沙星）Danofloxacin（简写Dan）、恩诺沙星Enrofloxacin（简写Enr）、氧氟沙星Ofloxacin（简写Ofl）、麻保沙星Marbofloxacin（简写Mar）、沙拉沙星Sarafloxacin（简写Sar）、双氟沙星Difloxacin（简写Dif）标准品（纯度≥99%）；乙腈、甲醇、正己烷均为色谱纯。

1.1.3 仪器与设备

Waters Xevo TQ⁃S液相色谱⁃串联质谱仪（美国）；METTLER电子天平（上海）：感量0.01 g和0.0001 g；IKA磁力搅拌器和漩涡混匀器；KH3200DE超声波仪（昆山）；Eppendorf 5810台式离心机（德国）；N⁃EVAP氮吹仪（美国）；Thermo 10～100μL，100～1 000μL，1～5 mL移液器。

1.2 样品制备

将刚采集的样品编号加标识后，每个样品取1～3枚蛋，去壳后，将蛋黄和蛋清一起匀浆制成蛋液，并立即以多抗试剂盒用免疫胶体金法快速筛检，蛋液留样用5 m L冷冻管分装，－20℃保存，以备胶体金法复检和LC⁃MS／MS法定量检测用；完整的禽蛋则根据胶体金法筛检结果分成阳性组和阴性组，于4～8℃冷藏保存。

1.3 多抗试剂盒免疫胶体金法快速筛检

快速筛检采用设计检测限为20μg·kg－1多抗免疫胶体金试剂盒，用滴管吸取0.5 mL蛋液，加1 mL复溶剂，摇匀制成待检溶液；从铝箔袋中取出胶体金试剂板；用滴管吸取待检溶液垂直滴加4滴（约125μL）于试剂板的加样孔中；加样后开始计时，在3～5 min内用肉眼观察结果，结果判定原则参照文献［3］。

1.4 单抗试剂盒免疫胶体金法复检

复检采用设计检测限为2μg·kg－1单抗免疫胶体金试剂盒，实验方法基本参照1.3节稍加改动，一是样品稀释倍数改为4倍，即吸取1 mL蛋液，加4 m L复溶剂，摇匀制成待检溶液；二是显色时间改为在5～8 min内读取结果。

1.5 用LC⁃MS／MS法检测禽蛋中喹诺酮类药物

称取2.00 g样品于15 mL试管中，加入4 mL酸化乙腈（2%甲酸）溶液，漩涡混匀，超声3min，4 000 r·min－1离心5 min，取上清，沉淀用4 mL酸化乙腈重复提取一次，合并上清，定容至25 mL。提取液中加入10 m L乙腈饱和正己烷溶液，振荡5 min，弃去上层正己烷，重复净化一次。氮气吹干。准确加入1 mL甲醇溶解，再加入1 mL水超声30 s，过0.22μm滤膜，制成上机待测液。LC⁃MS／MS测定的仪器条件：流动相A液为100%乙腈；B液为0.1%甲酸水溶，其他条件参照标准［4］，根据色谱保留时间和质谱碎片及其离子丰度比定性；外标法定量，分别通过计算峰高和峰面积定量。

2 结果与分析

2.1 胶体金法快速检测结果

用多抗试剂盒对所有样品进行现场快速筛检，共检出24份阳性样品（占总样品量的18.8%），其中14份为强阳性样品（占总样品量的10.9%）。用肉眼观察试剂板T线和C线的显色情况（图1），1＃和2＃样品T线比C线深或一样深，视为阴性；3＃样品T线比C线浅为阳性；10＃、11⁃1＃和11⁃2＃样品T线不显色视为强阳性。用单抗试剂盒对所有样品进行复检，共检出42份阳性样品（占总样品量的32.8%），其中24份为强阳性样品（占总样品量的18.8%）。

图1 肉眼观察试剂板T线和C线的显色情况

2.2 LC⁃MS／MS法检测结果

所有样品再用液相⁃串联质谱（LC⁃MS／MS）法检测氟甲喹、诺氟沙星、依诺沙星、环丙沙星、培氟沙星、洛美沙星、丹诺沙星、恩诺沙星、氧氟沙星、麻保沙星、沙拉沙星、双氟沙星等12种喹诺酮类药物残留量，测得喹诺酮类残留总量＞100μg· kg－1（实测值为110～2 137μg·kg－1）的样品14份，残留总量在20～100μg·kg－1（实测值为24.3～86.6μg·kg－1）的样品10份；残留总量在2.0～20μg·kg－1（实测值为2.0～11.7μg· kg－1）的样品16份；残留总量为0.2～2.0μg· kg－1（实测值为0.23～1.98μg·kg－1）的样品16份。不同污染程度样品所占比例见图2。

图2 按喹诺酮残留总量计不同污染程度样品所占比例

所检的12种喹诺酮类药物均有检出，其中检出率最高的是环丙沙星和氧氟沙星，各33份，其次为检出恩诺沙星的样品14份，诺氟沙星9份，依诺沙星8份，培氟沙星6份，氟甲喹和洛美沙星各3份，丹诺沙星、麻保沙星和双氟沙星各2份，沙拉沙星1份。环丙沙星和氧氟沙星不仅检出率高，残留量也很高，环丙沙星残留量大于100μg· kg－1的样品有7份，其最高残留量为715μg·kg－1；氧氟沙星残留量大于100μg·kg－1的样品有5份，其最高残留量为601μg·kg－1（图3），该样品中还检出麻保沙星留量为4μg·kg－1。培氟沙星的最高残留量达2 026μg·kg－1，该样品中还检出诺氟沙星、依诺沙星和环丙沙星，总残留量高达2 137μg·kg－1。

表1 LC⁃MS／MS法测得禽蛋中喹诺酮类残留总量

图3 氧氟沙星残留量最高的样品质谱图

2.3 胶体金法和质谱法检测结果比较

采用检测限为20μg·kg－1的多抗免疫胶体金试剂盒共检出24份阳性样品（其中强阳性样品14份），与质谱法检出喹诺酮总残留量＞20μg·kg－1样品合计24份（其中总残留量＞100μg·kg－1的样品14份），两种方法的检测结果符合率为100%。

采用检测限为2μg·kg－1的单抗试剂盒检出24份强阳性样品，与质谱检测结果完全相符。单抗免疫胶体金试剂盒共检出42份阳性样品，与质谱法检出残留总量＞2μg·kg－1的样品共40份相比较，符合率为95%，其中2个不相符的样品，质谱法检测残留总量分别为1.98和1.30μg· kg－1，1.98μg·kg－1的样品检出为阳性，认为在判定误差范围允许之内；残留总量1.30μg·kg－1的样品胶体金法检出为阳性，而其他残留总量在1.44～1.94μg·kg－1均检出为阴性，可能是因为除了本次实验中质谱所检的12种之外，还存在其他种喹诺酮药物残留，根据抗体研制时的测试结果，该抗体可与15种以上的喹诺酮药物发生反应。

3 小结与讨论

通过以胶体金法和质谱法检测禽蛋中喹诺酮残留的比较发现，这两种方法检测结果高度相符，且在禽蛋质量安全监测与控制中各有优势：胶体金法的主要优点是快速、方便，适合于现场快速检测，若参照农业部235号公告中畜禽肉中100μg·kg－1的限量要求，无论是多抗试剂盒还是单抗试剂盒的检测灵敏度均能完全满足质控要求；质谱法的主要优点是定性和定量准确，因此，这两种方法分别适合于现场检测和实验室确证及定量检测。

尽管农业部明令禁止在产蛋鸡中使用喹诺酮类药物，在研究中也发现杭州市在售禽蛋中的喹诺酮类残留情况较为严重，与目前我国养殖业不规范用药和在饲料中添加抗生素有关，这种禁而不止的现象多年来屡见不鲜，因此现场快速检测方法的研究对推进市场准入制度和产地准出制度的实施具有比较现实的意义。

［1］ 李金梅，李雨珊，刘华，等.健康儿童肠道大肠埃希菌产ESBLs菌株耐药性研究［J］.检验医学与临床，2015，12（3）：210－211.

［2］ 张国成.重视儿童超级细菌感染的诊断与治疗的研究［J］.发育医学电子杂志，2014，2（4）：193－197.

［3］ 柳爱春，刘超，赵芸，等.免疫胶体金法快速检测水产品中硝基呋喃类代谢物的研究［J］.浙江农业学报，2013，25（1）：95－102.

［4］ GB／T 21312—2007动物源性食品14种喹诺酮药物残留检测方法液相色谱⁃串联质谱法［S］.

（责任编辑：卢福庄）

S 83；TS 207.5

A

0528⁃9017（2015）11⁃1763⁃03

文献著录格式：柳爱春，刘超，赵芸，等.胶体金法和质谱法检测禽蛋中喹诺酮类残留的比较［J］.浙江农业科学，2015，56（11）：1763－1766.

DOI 10.16178／j.issn.0528⁃9017.20151119

2015⁃09⁃14

杭州市社会发展科研专项（20130533B24）

柳爱春（1972－），女，浙江永康人，高级工程师，本科，主要从事农产品安全检测和相关的科研工作。E⁃mail：liuaichun01＠163.com。