HPLC法测定六味首乌颗粒中二苯乙烯苷的含量

李洪泽 齐骁勇 韩风雨 孔新颖 刘福青

实验研究

HPLC法测定六味首乌颗粒中二苯乙烯苷的含量

李洪泽 齐骁勇 韩风雨 孔新颖 刘福青

目的建立高效液相色谱法(HPLC)测定六味首乌颗粒中二苯乙烯苷含量的方法。方法采用高效液相色谱法, 色谱柱为Luna5 μm, C18(2),250 mm×4.60 mm100 A。流动相为甲醇-0.2％磷酸溶液(29∶71), 流速为1.0 ml/min, 检测波长为320 nm。结果二苯乙烯苷浓度在4.99～29.94 μg/ml范围内呈良好的线性关系, r=0.9999；二苯乙烯苷平均回收率为98.42％, RSD为1.04％。结论高效液相色谱法测定方法操作简便、结果准确、重现性好, 可用于六味首乌颗粒的质量控制。

高效液相色谱法；六味首乌颗粒;二苯乙烯苷;含量测定

本方由制何首乌、淫羊藿、菟丝子、虎杖、川芎、白芍6味中药组成, 制何首乌为方中君药, 具有补肝肾, 益精血,乌须发, 强筋骨的作用。所含主要有效成分为2,3,5,4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷(以下简称：二苯乙烯苷), 该化合物具有广泛的心血管活性, 免疫调节, 保肝作用等, 因而常作为何首乌质控指标成分。故选择二苯乙烯苷作为定量分析成分, 以保证制剂的质量。通过试验及参考有关研究文献, 建立了高效液相法, 测定本制剂中二苯乙烯苷的含量。

1 材料与方法

1.1 材料 惠谱1100-型高效液相色谱仪；紫外Model500检测器；色谱柱为色谱柱 ：Luna5 μm, C18(2),250×4.60 mm100 A；AB135-S电子天平 ；Model C3860A超声波仪(上海超声仪器厂)。

六味首乌颗粒(批号：20050511, 内蒙古天奇中蒙制药股份有限公司)；二苯乙烯苷标准物质(含量测定用批号：110844-200404, 中国食品药品检定研究院)。甲醇为色谱纯,磷酸为分析纯, 纯净水(娃哈哈)。

1.2 方法

1.2.1 色谱条件与系统适用性试验 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇-0.2％磷酸溶液(29∶71)为流动相；检测波长为320 nm。理论板数按2,3,5,4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷峰计算应不低于3000。

1.2.2 对照品溶液的制备 精密称取2,3,5,4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷对照品适量, 加50％甲醇溶解制成每1 ml含20 μg的溶液, 即得。

1.2.3 供试品溶液的制备 取本品内容物适量, 研细, 取约0.3 g, 精密称定, 置具塞锥形瓶中, 精密加入50％甲醇50 ml,密塞, 称定重量, 超声处理(功率300 W, 频率40 kHz)30 min,放冷, 再称定重量, 用甲醇补足减失的重量, 摇匀, 滤过, 取续滤液, 即得。

1.2.4 阴性溶液的制备 取除制何首乌外的其他药材, 制成样品, 参照供试品溶液的制备方法, 制得阴性溶液。

2 结果

2.1 线性关系考察 分别精密吸取二苯乙烯苷对照品溶液(0.0998 mg/ml) 0.5、1.0、1.5、2.0、3.0 ml, 置10 ml量瓶中, 加50％甲醇稀释至刻度, 摇匀, 分别精密吸取各对照品溶液各20 μl, 注入液相色谱仪, 测定峰面积。以进样量为横坐标,峰面积为纵坐标, 绘制标准曲线, 其回归方程为：Y=69.89779.9199, r=0.9999。结果表明, 二苯乙烯苷浓度在4.99～29.94 μg/ml范围内有良好的线性关系, 见表1。

表1 线性关系进样量与峰面积表(μg/ml)

2.2 提取溶媒选择 取供试品数份, 精密称定, 分别加入甲醇、乙醇、50％甲醇、50％乙醇, 超声处理30 min, 按高效液相色谱法测定。结果表明, 采用上述四种溶剂提取, 但以50％甲醇提取含量最高, 测得的峰形良好, 分离度良好, 干扰峰较小, 故选择50％甲醇作为提取溶媒, 见表2。

表2 不同溶媒提取比较结果(mg/g)

2.3 提取方法及提取时间选择 取供试品数份, 加入50％甲醇, 分别采用超声处理与加热回流30 min方式提取, 按高效液相色谱法测定。结果表明, 两种提取方法的提取效率相差不大, 为方便起见, 采用超声提取。分别采用不同提取时间及不同超声功率进行考察, 见表3, 表4。

表3 不同提取方式含量数据表(mg/g)

表4 超声提取条件含量数据表(mg/g)

2.4 阴性对照试验 取对照品溶液、阴性溶液及供试品溶液, 注入色谱仪测定。结果表明, 阴性溶液与对照品色谱相同保留时间处无色谱峰, 供试品在对应位置色谱峰与相临峰分离度符合要求, 峰形好, 故阴性无干扰。

2.5 精密度试验 精密称取供试品适量, 按“供试品溶液的制备”项下方法制备, 重复进样5次, 测定峰面积, 见表5, RSD％为0.40％, 可见仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验 精密称取供试品, 按“供试品溶液的制备”项下制备, 分别于第0、4、8、12、16、20小时进样测定,结果表明供试品溶液在20 h内基本稳定, 见表6。

表5 精密度试验结果

2.7 重复性试验 精密称供试品, 按“供试品溶液的制备”项下制备, 依法测定, 结果其含量平均值为4.83 mg/g, RSD=1.6％, 表明此方法重复性良好, 见表7。

2.8 回收率试验 精密称取已知含量的同一批样品(批号：20050511)约0.1 g, 分别精密加入二苯乙烯苷对照品溶液(0.486 mg/ml)1.0 ml, 按“供试品溶液的制备”方法制备, 依法测定, 按下式计算回收率, 见表8。

表7 重复性试验(mg/g, ％)

表8 二苯乙烯苷回收率测定结果(mg, ％)

3 样品测定

取三批中试样品, 按含量测定方法, 依法测定, 见表9。

根据以上测定结果, 暂定本品每袋含二苯乙烯苷(C20H22O9)应不得少于12.5 mg。

表9 样品测定结果(mg/袋)

4 讨论

4.1 样品提取条件的选择在研究过程中分别进行了不同溶剂(甲醇、50％甲醇、50％乙醇)、不同提取方法(超声处理、回流提取)和不同提取时间(20、30、40 min)的比较, 最后确定以50％甲醇超声处理30 min为最佳。

4.2 本试验的二苯乙烯苷含量测定的色谱条件, 能使二苯乙烯苷与其他组分达到较好的分离, 线性关系、精密度、稳定性、重复性、回收率数据均符合定量要求, 可作为六味首乌颗粒质量标准中二苯乙烯苷含量测定的测定方法。

综上所述, 该测定方法操作简便、结果准确、重现性好,可用于六味首乌颗粒的质量控制。

Content determination of stilbeneglycoside in Liuwei Polygonum multiflorum Thunb granules by HPLC

LI Hong-ze, QI Xiao-yong, HAN Feng-yu, et al. Inner Mongolia Tianqi Zhongmeng Pharmaceutical Limited Liability Company, Chifeng 024000, China

ObjectiveTo establish a method for content determination of stilbeneglycoside in Liuwei Polygonum multiflorum Thunb granules by high performance liquid chromatography (HPLC).MethodsHPLD was applied by chromatographic column as Luna5 μm, C18(2),250 mm×4.60 mm100 A. The mobile phase was methyl alcohol -0.2％ phosphoric acid solution (29:71) with1.0 ml/min of flow rate and320 nm of detection wavelength.ResultsThe concentration of stilbeneglycoside showed a good linear correlation in the range of4.99～29.94 μg/ml, r=0.9999. The average recovery rate of stilbeneglycoside was98.42％, RSD=1.04％.ConclusionHPLC has the advantages of easy operation, precise effect, and good reproducibility. It can be applied for quality control of Liuwei Polygonum multiflorum Thunb granules.

High performance liquid chromatography; Liuwei Polygonum multiflorum Thunb granules; Stilbeneglycoside; Content determination

10.14164/j.cnki.cn11-5581/r.2015.02.159

2014-10-09］

024000 内蒙古天奇中蒙制药股份有限公司(李洪泽)；内蒙古天奇药业投资(集团)有限公司(韩风雨)；赤峰陆尔草中蒙药科技有限公司(孔新颖)；内蒙古蒙吉药业科技有限责任公司(刘福青)；内蒙古博泰现代蒙药制剂研究开发有限公司(齐骁勇)