比较人AB型血清与胎牛血清在结核杆菌裂解物刺激人外周血单个核细胞中的作用

金　亮，张　茜，沙　泉

(安徽医科大学免疫学教研室及过敏与免疫研究中心，安徽 合肥　230032)



比较人AB型血清与胎牛血清在结核杆菌裂解物刺激人外周血单个核细胞中的作用

金亮，张茜，沙泉

(安徽医科大学免疫学教研室及过敏与免疫研究中心，安徽 合肥230032)

摘要:目的观察添加人AB型血清或胎牛血清(FBS)培养基培养的人外周血单个核细胞(PBMC)在结核杆菌 (M.tb) 全菌裂解物 (WCL)的刺激下增殖差异。方法健康成人PBMC 1×109·L-1，分别加入WCL 20 mg·L-1，或者同时给予人重组白细胞介素-2(rhIL-2)50 U·mL-1，植物血凝素(PHA)5 mg·L-1，同时设置空白对照组。分别在含10%人AB型血清的RPMI1640培养液和10%FBS 的RPMIl640培养液中培养6 d后，用倒置显微镜观察培养结果，运用流式细胞术检测淋巴细胞增殖情况。结果添加人AB型血清培养基培养条件下，M.tbWCL对淋巴细胞增殖效果较同样条件下添加FBS培养的增殖效果明显，差异有统计学意义(P<0.05)。在WCL和rhIL-2混合组中同样是添加人AB型血清培养增殖效果明显，差异有统计学意义(P<0.05)。结论当以M.tbWCL为抗原的刺激人PBMC时，淋巴细胞在添加人AB型血清培养液中比在添加FBS的培养液中增殖效果更加明显。

关键词:结核分枝杆菌;人AB型血清;胎牛血清;外周血单个核细胞

结核病是一种严重危害人类生命健康的传染病，根据世界卫生组织(WHO)2013年报告，全世界估算每年新增860万结核患者，有约130万人死于结核病(包括32万艾滋病阳性者)，中国占新增病例数的12%，仅次于印度(26%)居世界第二位，而现有的抗结核药物的副反应高达13%，在一些高龄，肝炎史，营养状态低下的患者中副反应发生率更高，更严重[1]。如此高的患病率和高死亡数，令人难以承受，所以对结核病的防治和研究也一直是各国政府扶持的重点之一。

目前对M.tb的研究主要是运用M.tb的不同成分或者其自身分泌蛋白作为抗原，诱导不同的免疫细胞(γδT细胞、CD3+细胞等)发生反应，从而深入探究相关机制，以便于研制出新的疫苗或者抗结核药物。例如M.tb的菌壁上含有大量的脂蛋白可以通过DC介导的MHCⅡ途径上调IFN+CD4+细胞的表达，从而起到免疫保护作用[2]。由于此类研究一般都要进行体外细胞培养，而血清又是细胞体外培养中使用最广泛的细胞培养基成分，含有丰富的细胞生长所必须的营养物质，是良好的添加剂。目前最主要的选择是动物血清，如小牛血清，新生牛血清，以及胎牛血清等。因为胎牛还未接触外界，血清中所含的抗体、补体等对细胞有害的成分最少，所以胎牛血清的使用较为广泛。然而FBS中依然存在可能的各种病毒，支原体和朊病毒等[3]。人AB型血清具有同源性，在骨髓间充质干细胞[4]，滑膜细胞[5]，人结膜上皮细胞[6]，施万细胞[7]，脐静脉内皮细胞[8]等细胞的研究表明与胎牛血清相比，用人AB型血清培养的细胞能更好的促使细胞增殖生长，保持其特有功能。本实验目的就是探讨两种血清在PBMC增殖实验中的效果。

1材料与方法

1.1M.tb抗原及其配制

1.1.1抗原种类由M.tbH37Rv株制备的全菌裂解物(H37Rv，Whole Cell Lysate，WCL，NR-14822)，由BEI Resources，美国国家过敏和传染病研究所(NIAID)，美国国立卫生院(NIH)提供。

1.1.2抗原的配制WCL抗原采用无菌PBS稀释至1 g·L-1。

1.2试剂和仪器淋巴细胞分离液，天津TBD公司；培养基RPMI1640，HyClone公司产品；胎牛血清(FBS)购于北京元亨金马生物技术公司；人AB型血清，人白细胞浓缩液，安徽省合肥市红十字中心血站；重组人白细胞介素2(rhIL-2)BD公司；流式细胞仪FACSVerse，BD公司；植物血凝素(PHA)，sigma；荧光染料 CFSE，invirtrogen； PI，sigma。

1.3人AB型血清制取取AB型血浆(n=5)混合，灭活后先置于-20℃中50 min，室温下溶解后，再置于离心机15 000 rpm，1 h，4℃。之后取上清液并冻存于-20℃备用。

1.4CFSE染色人白细胞浓缩液经淋巴细胞分离液获得PBMC，用不含血清的RPMI1640培养液调整至2×109·L-1的细胞悬液，加入CFSE(终浓度1 μmol·L-1)，37℃染色10 min后分别用含10%FBS的RPMI1640或10%AB血清的PRMI1640培养液洗涤，调整细胞浓度至0.5×109·L-1。

1.5抗原刺激培养将CFSE染色后的PBMC培养于96孔培养板中(圆底)每孔200 μL，设空白对照组，WCL组(20 mg·L-1)，阳性组PHA(5 mg·L-1)，以及WCL加IL-2(50 U·mL-1)，该组IL-2每3 d补充一次，剂量相同。连续培养6 d。

1.6细胞增殖分析(1)在培养初期至末期分别用倒置显微镜观察细胞生长变化。(2)至第6天，收集细胞，洗涤后加入PI(100 mg·L-1)。用流式细胞术检测，通过淋巴细胞的大小以及PI的特点，用门(gate)圈取活的淋巴细胞，再根据CFSE的荧光强度对门内细胞进行分析，所得数据分析采用Fcs Express软件。

1.7统计学分析采用SPSS 17.0软件进行方差检验，P<0.05具有统计学意义。

2结果

2.1外周血淋巴细胞生长的动态观察各组在生长第一天两种血清培养下的PBMC无明显区别，随着培养时间延长细胞开始分裂生长，并逐渐形成集落。对照组生长极为缓慢，至6 d时几乎无明显增长。PHA组增长则极为迅速至3 d时都以形成大团集落，但至6 d时集落变小，提示可能细胞开始死亡。至于WCL组初始无明显区别，至6 d观察，AB型血清组细胞增长FBS组较为明显，集落较多，也较密(图1)。

注：A、C：AB型血清培养组；A：培养1 d，C：培养6 d;B、D：FBS组；B：培养1 d，D: 培养6 d。

2.2外周血单核细胞增殖检测运用流式细胞仪检测CFSE的荧光强弱，分析淋巴细胞增殖情况，同时检测PI以去除死细胞。运用统计学分析各组情况(图2)。结果：空白对照组的两种血清组均无明显增殖，且差异无统计学意义(P>0.05)。PHA刺激条件下FBS组(77.0±23.76)%的淋巴细胞较AB型血清组(62.96±17.75)%增殖效果好，差异有统计学意义(P<0.05)。在WCL刺激条件下，人AB型血清组(31.57±18.69)%(图3A)的淋巴细胞要比FBS组(15.99±9.15)%(图3B)的增殖效果好，差异有统计学意义(P<0.05)，WCL加IL-2组中人AB型血清组(44.90±15.77)%(图4A)的淋巴细胞比FBS组(30.79±13.27)%(图4B)增殖效果好，差异有统计学意义(P<0.05)。

注：*P<0.05 vs FBS组，control组n=13，PHA组n=11，WCL组n=13，WCL+IL-2组n=9。

注：A：AB型血清组；B：FBS组。

注：A：AB型血清组；B：FBS组。

3讨论

由于M.tb是胞内寄生菌，抗体无法进入胞内，所以人体对M.tb的免疫方式主要依靠细胞免疫，而细胞免疫多数都是依靠树突状细胞(DC)或者巨噬细胞抗原呈递给T细胞，从而激活效应细胞，产生免疫效应[9-10]。而在单独培养的DC中，若添加人AB型血清或者自体血清后，培养后的DC无论是在功能，特异性表面分子(CD83,CD86等)的表达上均要优于同等条件下添加胎牛血清或者无血清培养的DC[11]。此外在M.tb感染中IL-2、IL-4等细胞因子也起到了重要作用，特别是在未感染和已感染人群中存在显著差异。对细胞因子的研究往往也需要进行体外实验，但是在体外实验时，由于需要较长的培养时间，才能使得免疫细胞活化增殖，所以为了避免细胞过早死亡，就需要一种优秀的添加剂。血清可以使得细胞在更好的环境中生长，特别是在培养周期较长的实验中，其效果更加明显。虽然血清中的有些成分对细胞的生长具有利的影响，例如大分子的蛋白质、核酸及营养因子等，对促进细胞的生长繁殖、黏附及中和某些毒性物质起着一定的作用，但是同时也含有一些会不利于细胞生长的物质，例如当球蛋白>20 g·L-1时，并在某些物质的作用下，就会出现影响细胞正常生长发育的细胞毒性作用。通过添加人AB型血清可以适当提高培养液中白蛋白的含量，降低球蛋白的含量，有利于细胞的生长[12]。此外血清中含有的血小板原生长因子(PDGF)可直接作用于细胞周期，使细胞周期转换时间缩短，加速细胞的分裂和增殖[13]。而在人血清中的PDGF含量要高于其在FBS中的含量，这可能也是一个重要的因素[14]。在本实验中，在PHA刺激条件下，FBS组淋巴细胞增殖较人AB型组多，可能是由于培养时间较长，导致营养液不够，使得人AB型血清组中的细胞在较早时就开始死亡，而死亡细胞的成分又进一步抑制其他细胞增殖。而实验组由于WCL不是有丝分裂原，需要较长时间才能使PMBC增殖。若是加入IL-2则能加快细胞增殖，维持细胞的生长。至于人AB型血清中是否还含有其他促进细胞生长的物质，或者是有能更好的促使M.tb裂解物诱导免疫细胞活化增殖的成分还待以后进一步的深入研究。本实验表明在体外培养中，添加人AB型血清培养的淋巴细胞对M.tbWCL刺激的增殖效果明显，可以作为良好的细胞培养基成分。

参考文献：

[1]缪志伟．抗结核药物所致不良反应发生情况及相关危险因素分析[J]．安徽医药，2013，17(1)：168-169．

[2]Seshadri C,Turner M,Lewinsohn,D.Lipoproteins are major targets of the polyclonal human T cell response to Mycobacterium tuberculosis[J].Immunol,2013,190(1):278-284.

[3]Van der Valk,M,Brands R,et al.The humane collection of fetal bovine serum and possibilities for serum-free cell and tissue culture [J].Toxicol In Vitro,2004,18(1):1-12.

[4]娄典．体外扩增临床应用骨髓间充质干细胞的研究进展[J]．医学综述，2013，19(10)：1748-1750．

[5]刘青松，朱兴春，李君安，等．丹参注射液对人血清培养类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞增殖的影响[J]．中国中西医结合杂志，2013，2013(33)：5-8．

[6]Ang L,Seah C.The use of human serum in supporting the in vitro and in vivo proliferation of human conjunctival epithelial cells[J].Brit J Ophthalmol,2005，89(6): 48-52.

[7]林兰，郑亚琳，黄达，等．不同血清微环境培养的施万细胞增殖状况比较[J]．医学研究杂志，2013，42(8)：31-33．

[8]李东升，邵素玲，杨万松，等．人脐静脉内皮细胞体外培养及鉴定[J]．临床和实验医学杂志，2012，11(18)：1444-1445．

[9]Kaufmann S.How can immunology contribute to the control of tuberculosis?[J].Nat Rev Immunol,2001,1(1):20-30.

[10] Vincent M,Brenner M.Understanding the function of CD1-restricted T cell[J]. Nat Immunol,2003，4(6): 517-523.

[11] 易慧君，卢光琇．不同来源血清或血浆培养条件下的树突状细胞表型和功能的比较[J]．细胞与分子免疫学杂志，2012，28(6)：561-567．

[12] 王凌峰，荣志东，巴特，等．含AB型血清培养体系人角质形成细胞培养[J]．内蒙古医学院学报，2006，28(5)：384-387．

[13] R.I.弗雷谢尼 主编．动物细胞培养——基本技术指南[M].5版．北京：科学出版社， 2008：484．

[14] 鲁华，鲁峰．两种方法提取的人血清对体外培养人真皮成纤维细胞促增殖作用比较研究[J]．南方医科大学学报，2012，32(1)：61-65．

关于文稿中法定计量单位的书写要求

本刊法定计量单位实行国务院1984年2月颁布的《中华人民共和国法定计量单位》，并以单位符号表示，具体使用参照1991年中华医学会编辑出版部编辑的《法定计量单位在医学上的应用》一书。注意单位名称与单位符号不可混合使用，如ng·kg-1·天-1应改为ng·kg-1·min-1；组合单位符号中表示相除的斜线多于1条时，应采用负数幂的形式表示，如ng/kg/min应采用ng·kg-1·min-1的形式；组合单位中斜线和负数幂亦不可混用，如前例不宜采用ng/kg·min-1的形式。在首次出现不常用的法定计量单位处用括号加注与旧制单位的换算系数，下文再出现时只列法定计量单位。人体及动物体内的压力单位使用mmHg或cmH2O,但文中首次出现时用括号加注(1 mmHg=0.133 kPa)。正文中时间的表达，凡前面带有具体数据者应采用d、h、min、s，而不用天、小时、分钟、秒。量的符号一律用斜体字母，如吸光度(旧称光密度)的符号为A,“A”为斜体字。

Comparsion of Mycobacterium tuberculosis Whole Cell Lysate effects on

proliferation of human peripheral blood mononucelear cells in

human AB type serum and fetal bovine serum

JIN Liang,ZHANG Xi,SHA Quan

(DepartmentofMedicalImmunologyandAllergyandImmunologyResearchCenter,

AnhuiMedicalUniversity,Hefei230032,China)

Abstract:ObjectiveTo observe the proliferation difference of human peripheral blood mononucelear cells (PBMCs) which were stimulated with Mycobacterium tuberculosis (M.tb) Whole Cell Lysate (WCL) in human AB serum cell culture medium and fatal bovine serum (FBS) cell culture medium.MethodsPBMCs from healthy adults were stimulated by WCL or WCL with recombinant human interleukin 2 ( rhIL-2) or phytohemagglutinin (PHA) or none as control in four groups.Each of the groups was cultured with RPMI-1640 medium containing 10% AB serum or 10% FBS for six days respectively.The proliferation of lymphocytes was carefully investigated under the inverted microscope and flow cytometry.ResultsThe proliferation of lymphocytes stimulated by WCL in medium with 10% AB serum is better than that in medium with 10% FBS (P<0.05).Similar results were obtained when PBMCs were stimulated by WCL and rhIL-2 (P<0.05) .ConclusionWhen human PBMCs were stimulated withM.tbWCL,the proliferation of lymphocytes was better in the culture medium supplemented with human AB serum than in that with FBS serum.

Key words:mycobacterium tuberculosis;AB type of human serum;fetal bovine serum;PBMC

(收稿日期：2014-05-15，修回日期：2014-08-07)

doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2015.02.021

通信作者：沙泉，女，教授，硕士生导师，研究方向：过敏与气道免疫，E-mail：qsha2@yahoo.com

作者简介：金亮，男，硕士研究生

基金项目：国家自然科学基金(No 81273245);安徽省国际科技合作计划(No 11030603027)