阿尔茨海默病患者外周血单核细胞中CD33的表达情况

朱　黎，成旭东，安燕芳

(徐州市第一人民医院老年科，江苏 徐州 221000)



阿尔茨海默病患者外周血单核细胞中CD33的表达情况

朱黎※，成旭东，安燕芳

(徐州市第一人民医院老年科，江苏 徐州 221000)

摘要：目的研究阿尔茨海默病(AD)患者外周血单核细胞CD33的表达情况，探讨其作为血液生物标志物的可行性。方法收集2011年1月至2013年3月徐州市第一人民医院收治的100例AD患者(AD组)和100例认知正常老年人(对照组)的临床资料和外周静脉血标本,分离外周血单核细胞，采用实时荧光定量多聚酶链反应测定CD33mRNA表达水平，流式细胞仪分析CD33阳性细胞率。采用Pearson相关分析CD33表达与简易精神状态检查(MMSE)评分的关系。结果AD患者CD33mRNA表达水平和CD33阳性细胞率均显著低于对照组[0.89±0.28 比1.06±0.33；(40±15)%比(55±21)%]，差异有统计学意义(P<0.01)。CD33mRNA表达水平、CD33阳性细胞率与MMSE评分呈正相关(r=0.78，0.22，P<0.05)。结论CD33可能参与AD的发病过程，CD33作为AD临床诊断生物标志物具有一定的可行性。

关键词：阿尔茨海默病；CD33；外周血单核细胞；生物标志物

阿尔茨海默病(Alzheimer′s disease,AD)是一种最常见的年龄相关性痴呆,60岁以上人群患病率高达1.6%，目前AD患者约530万人，2050年预计将达到1350万人，AD已成为一种严重影响老年人身心健康的公共卫生问题[1]。由于AD发病机制复杂，疾病产生的原因和机制尚不明切，目前仍无有效治疗方法，且发病隐匿，只有当个体表现出认知、行为障碍时才能进行诊治，因此，对AD早期诊断并干预治疗具有重要价值[2]。但批准的、公认的用于AD检测的生物标志物尚不存在，疾病的发生、进展无法得以确定。CD33分子主要存在于血液、骨髓和淋巴细胞中，相对分子质量为67 000，属于唾液酸结合免疫球蛋白的凝集素家族成员，大范围全基因组相关研究表明，CD33与AD密切相关[3-4]。本研究主要探讨CD33的表达与AD患者认知功能的关系，为AD诊断和治疗提供思路和依据。

1资料与方法

1.1一般资料收集2011年1月至2013年3月徐州市第一人民医院收治的符合精神疾病诊断和统计手册[5]及美国国立神经病、语言交流障碍和卒中研究所-老年性痴呆及相关疾病学会诊断标准[6]的AD患者100例(AD组)，记忆障碍和遗忘为主诉，病程6个月至4年。采用简易精神状态量表(mini-mental state examination，MMSE)和蒙特利尔认知评估量表(montreal cognitive assessment，MoCA)对患者进行认知功能评定。排除标准：①其他痴呆相关的神经系统疾病，如癫痫、帕金森病、亨廷顿病、抑郁症、精祌分裂症、精神发育迟滞者；②药物滥用，有既往脑血管病、脑积水、脑炎或脑膜炎病史者；③头部外伤或各类中毒导致认知功能障碍者；④严重的肝、肾功能损害及恶性肿瘤患者；⑥严重视觉或听觉障碍，不能配合检查者。另择上述AD组患者配偶或同期收治的认知正常的老年人为对照组,共100例，对照组排除标准同AD组。

1.2外周血单核细胞分离清晨空腹采集外周静脉血约2 mL，乙二胺四乙酸抗凝血，加入2 mL磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline，PBS)稀释后，缓慢加入5 mL Ficoll淋巴细胞分离液(BD，美国)，以离心半径13 cm，2000 r/min离心20 min，分离中间的血浆单核细胞层，PBS冲洗2次，以离心半径13 cm，1500 r/min，离心10 min，弃上清液，收集下层液以PBS稀释调整浓度，配制成1×106/mL的细胞悬液备用。

1.3CD33mRNA定量检测分离出外周血单核细胞后，采用Trizol试剂盒(天泽恩，中国)提取总RNA，逆转录试剂盒(Takara，中国)将RNA逆转录成cDNA。荧光定量检测试剂盒(Takara，中国)，CD33引物为F端序列:5′-GAAAGCAGCCAGGACAGCA-3′，R端序列： 5′-CTGAACAGCTTGAGGGTT-TCAGTG-3′；甘油三磷酸脱氢酶引物为F端序列:5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′、R端序列：5′-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3′。采用实时荧光定量多聚酶链反应扩增仪(BIORAD，美国)进行实时荧光定量多聚酶链反应，20 μL反应体系：包括2×SYBR Green实时荧光定量多聚酶链反应缓冲液10 μL,4种引物各0.4 μL(10 μmol/L)，cDNA模板2 μL，双蒸水6.4 μL。反应参数:95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共40个循环。每个样本2个复孔，2-ΔΔCT法计算CD33mRNA的相对表达量。

2结果

2.1两组受试者一般特征的比较两组性别、年龄、受教育年限比较差异无统计学意义(P>0.05)，AD组MMSE和MoCA 评分均低于对照组，差异有统计学意义(P<0.01)。见表1。

表1　两组受试者一般特征的比较

AD：阿尔茨海默病；MMSE：简易精神状态量表；MoCA：蒙特利尔认知评估量表；a为χ2值，余为t值

图1　CD33阳性流式细胞仪计数　1A：对照组； 1B：阿尔茨海默病组

图2　对照和阿尔茨海默病(AD)组外周血单核细胞CD33表达　2A： CD33 mRNA相对表达量； 2B： CD33阳性率2.3　AD患者CD33表达与MMSE的相关性分析　CD33 mRNA表达与MMSE评分呈正相关(r=0.78，P<0.05)；CD33阳性单核细胞比率与MMSE评分呈正相关(r=0.22，P<0.05)。

3讨论

CD33属于免疫球蛋白超家族的成员,与蛋白酪氨酸磷酸酶结合向细胞内传递抑制性信号，参与细胞增殖调节、细胞因子分泌等过程[7]。但目前CD33的信号传递通路仍没有很好地描述,实验模型显示[8-9]，其下游信号分子包括泛素连接酶、脾酪氨酸激酶等。在髓系细胞中脾酪氨酸激酶信号通路与细胞黏附、增殖、分化、凋亡有关。CD33属于髓系分化抗原,主要分布于髓系细胞,其研究主要是急性髓系白血病治疗,已有一些以CD33为靶点的药物处于临床研究阶段，用于白血病的治疗[10]。病理组织学显示，AD患者大脑皮质CD33异常表达[11]。一项关于中国北方汉族人群迟发型AD的全基因组关联分析表明，CD33基因与AD发病密切相关[12]。

由于AD主要表现为认知功能障碍，MMSE是最常用的痴呆及认知功能评价表，量表包含记忆力、视空间功能、执行功能、注意力、计算力、语言功能、定向力等方面的内容，具有操作简便、耗时短等优点，以MMSE得分反映认知功能受损程度具有一定的特异性[16]。本研究探讨了CD33表达水平和认知功能的相关性，Pearson相关分析表明，AD患者外周血单核细胞的CD33mRNA表达水平和CD33阳性单核细胞率与MMSE得分呈正相关，提示检测外周血单核细胞CD33表达水平作为AD预测的标志物具有一定的应用潜力。CD33在急性髓系白血病相关的鉴别诊断中已显示了较好的敏感性[17]。有研究小组正致力于将一个治疗急性髓性白血病失败的药物林妥珠单抗用于AD的治疗，林妥珠单抗已通过人体安全测试，有望成为AD的克星，也为AD的诊断、治疗研究提供了新策略[18]。

综上所述,AD患者外周血细胞中CD33的表达明显高于认知正常老年人，具有一定的临床意义，该方法特异性高，且外周血检查对人体伤害性低，CD33有望成为用于AD诊断的一种新的特异性明显的生物学标志物。但是，通过外周血检测CD33是否能区分不同疾病程度的AD患者，特别是对于轻度认知障碍的AD患者，是否还具有特异性仍值得探讨；对于AD患者外周血中CD33表达下调的相关机制，有待进一步研究。

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Application of CD33 as Blood Biomarker in Alzheimer DiseaseZHULi,CHENGXu-dong,ANYan-fang.(DepartmentofGeriatrics,FirstPeople′sHospitalofXuzhou,Xuzhou221000,China)

Abstract：ObjectiveTo investigate the feasibility of CD33 expression in peripheral blood mononuclear cells(PBMCs) as a biomarker in Alzheimer disease(AD).MethodsA total of 200 cases in Xuzhou First People′s Hospital were selected from Jan.2011 to Mar.2013,including 100 AD patients and 100 controls.CD33mRNA level was determined by real-time quantitative polymerase chain reaction and the CD33positive monocytes was analyzed by flow cytometry.Pearson correlation was performed to analyze the correlation between CD33expression and Mini Mental State Examination(MMSE) score.ResultsThe expression of CD33mRNA and proportion of CD33positive monocytes were significantly decreased in AD patients compared with the controls[0.89±0.28 vs 1.06±0.33，(40±15)% vs (55±21)%，P<0.01].Regression analysis showed the expression of CD33mRNA,CD33positive monocytes had positive relationship with the MMSE score(r=0.78，0.22，P<0.05).ConclusionCD33may play an important role in the pathogenesis of AD and is feasible to serve as a blood biomarker in AD diagnosis.

Key words：Alzheimer disease; CD33; Peripheral blood mononuclear cells; Biomarker

收稿日期：2015-05-21修回日期：2015-08-04编辑：伊姗

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.19.069

中图分类号：R392

文献标识码：A

文章编号：1006-2084(2015)19-3642-03