沉默人肺癌A549细胞中期因子基因表达对细胞凋亡的影响

孙常铭，王丽萍，刘 敏，赵维川，朴宗方，张秀琴

（承德医学院附属医院检验科，河北承德067000）

中期因子（MK）就是与肿瘤发生和发展有密切关系的基因。MK 能调节细胞生长、存活和分化，并参与肿瘤发病过程［1-4］。在许多不同类型的肿瘤中表达增强，包括食管癌、胃癌、结直肠癌、胰腺癌、胆囊癌、肺癌、甲状腺癌、乳腺癌、膀胱癌、子宫癌、卵巢癌、前列腺癌和肝癌、神经细胞瘤、恶性胶质瘤、髓系白血病［5］，阳性表达率45%～90%，MK 在正常组织中不表达或低表达［6］。所以，血清MK 水平有望成为一个新的肿瘤标志物［7］。MK 可以促进肿瘤血管的生成，增强肿瘤的耐药性，抑制细胞凋亡。到目前为止，MK 基因在肺癌细胞凋亡抑制中的可能作用尚不清楚。本研究采用转录载体Pgenesil-2.1靶向构建MK 的siRNA 真核表达载体，转染人肺癌A549细胞。采用RT-PCR、Western blot、流式细胞术的方法，观察MK siRNA 对A549 细胞mRNA、蛋白的表达和细胞凋亡的影响。从而为肺癌的治疗提供理论基础，同时为肿瘤的治疗和预后判断提供新的监测指标。

1 材料与方法

1.1 细胞与材料 人肺癌细胞株A549（承德医学院附属医院中心实验室）；RT-PCR 试剂盒、T4DNA Ligase、EcoRⅠ内切酶、SacⅠ内切酶、RNAiso试剂（大连宝生物公司）。含有新霉素G418抗性基因和卡那霉素抗性基因的Pgenesil-2RNA 干扰质粒载体，-20 ℃保存（武汉晶赛公司）；晶赛通用阴性对照质粒（Pgensil-2-HK）其形成的siRNA 干扰序列为5′-GAC TTC ATA AGG CGC ATGC-3′，此序列不与任何人类基因序列同源；AnnexinⅤ-FITC细胞凋亡检测试剂盒（江苏碧云天公司）；caspase-3酶特异性底物DEVD-para-Nitroanilide及特异性抑制剂DEVD-CHO 试剂盒（瑞士Bachem 公司）。

1.2 方法

1.2.1 MK siRNA 干扰质粒的 构建 （1）siRNA 的设计：根据GeneBank MK 基因序列（NM001012333），结合MK mRNA的二级结构，设计了一条特异性的针对MK 基因389～407bp的19nt的siRNA，序列为5′-GTA CAA GTT TGA GAA CTG G-3′。BLAST 分析排除其同源序列。（2）合成编码siRNA 的DNA 序列：结构CACC ＋Sense＋Loop＋Antisense＋终止信号＋SacⅠ，MK-2.1-A：5′-CAC CGT ACA AGT TTG AGA ACT GGT TCA AGA CGC CAG TTC TCA AAC TTG TAC TTT TTT G-3′；MK-2.1-B：5′-AGC TCA AAA AAG TACA AGT TTG AGA ACT GGC GTC TTG AAC CAG TTC TCA AAC TTG TAC-3′。均由武汉晶赛公司合成。

1.2.2 细胞培养及转染 A549细胞株在10%胎牛血清RPMI 1640培养基，37 ℃，5%CO2，饱和湿度的条件下培养。以下实验均取对数生长期细胞。选择对数生长期的细胞在6孔板中接种1.0×106个／孔A549细胞，培养24h，待细胞密度为80%～90%左右，用于第2 天转染。细胞分组，（1）转染MK siRNA 的实验组：10%胎牛血清RPMI 1640中含有MK siRNA 干扰质粒，400μg／mL的G418浓度持续筛选2～3周，其间每2～3天换1次含G418的培养液，同时转入培养瓶中扩大阳性克隆；（2）阴性对照组：转染阴性对照质粒；（3）空白对照组：未转染的A549细胞。

1.2.3 RT-PCR 检 测MK mRNA 的表达水平MK上游引物：5′-GCT ACA ATG CTC AGT GCC AGG A-3′；MK下游引物：5′-AAG GCA CTG GTG GGT CAC ATC-3′。以GAPDH 基因为参照基因，GAPDH上游引物：5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3′；下游引物：5′-TCC ACC ACC CTG TTG CTG TA-3′。

1.2.4 MK 蛋白表达水平检测 分别收获实验组、阴性对照组和空白对照组细胞，离心收集细胞，PBS洗涤，弃上清液，重新悬浮细胞，加入4×蛋白提取液，蛋白定量后，以β-actin作为内参，蛋白免疫印迹法（Western blot）检测。

1.2.5 MK siRNA 转染对A549细胞凋亡的影响 流式细胞仪进行细胞凋亡检测（AnnexinⅤ-FITC和PI双染法），分别检测3组细胞的早期凋亡情况。

1.2.6 caspase-3检测 在酶标仪上分别测定405nm 时各细胞的吸光度（OD），每组细胞重复测定3次。

1.3 统计学处理 采用SPSS14.0软件进行统计分析，计量资料采用±s表示，组间比较行单因素方差分析。检验水准α＝0.05，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 RT-PCR 检测3组细胞中MK mRNA 的表达水平 结果以MK 平均光密度值／GAPDH 平均光密度值表示。实验组（0.05±0.03）分别与阴性对照组（0.29±0.01）和空白对照组（0.30±0.01）比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。而阴性对照组与空白对照组差异无统计学意义（P＞0.05）。实验组MK的mRNA 表达相对于空白对照组下降了83.3%。

2.2 Western blot检测3组细胞的MK 蛋白表达水平 空白对照组（0.28±0.01）与阴性对照组（0.27±0.01）MK 蛋白表达水平差异无统计学意义（P＞0.05）。实验组（0.03±0.01）分别与阴性对照组和空白对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。实验组MK 蛋白的表达是空白对照组的0.107倍。即实验组的MK 蛋白表达相对于空白对照组下降了89.3%。见图1。

图1 3组细胞的蛋白表达结果

2.3 流式细胞仪进行细胞凋亡检测（AnnexinⅤ-FITC和PI双染法） 如图2显示，在双变量流式细胞仪的散点图上，正常的活细胞位于左下象限，早期凋亡细胞位于右下象限，而坏死细胞和晚期凋亡细胞位于右上象限。实验组A549细胞凋亡比阴性细胞早期凋亡高15.5倍。比空白组细胞早期凋亡高9.34倍。实验组出现了自发凋亡现象，具有较高的早期凋亡率。

图2 3组细胞细胞凋亡水平的变化

2.4 caspase-3活性检测 实验组（0.308±0.008）caspase-3活性明显高于阴性对照组（0.054±0.002）和空白对照组（0.055±0.001），而阴性对照组和空白对照组的caspase-3活性差异无统计学意义（P＝0.196）。

3 讨 论

肺癌细胞的凋亡抑制可以使肿瘤细胞对机体产生较大的影响，使肿瘤在体内大量聚集，引起肿瘤患者出现各类相关临床症状和临床表现。因此从分子水平探讨肺癌细胞的凋亡，对肺癌的治疗有着非常重要的意义。

在肿瘤的各种治疗方法中，以RNAi为主要技术手段的基因治疗已经得到广泛的关注。RNAi是近年来发现的一种调节mRNA 的生物学技术，能够使基因的mRNA 被相应的双链RNA 分子敲除，达到基因沉默的目的，其效果要强于正义和反义RNA［8］。RNAi最主要的功能在于可以调节和关闭基因的表达，进而调控细胞的各种高级生命活动。这种现象属于转录后的基因沉默机制。而siRNA 是指RNAi过程中在细胞内产生的长21～25个核苷酸的小双链RNA 分子，是RNAi作用机制的重要中间效应分子。目前已经有人工合成的siRNA，具有明显的敲除相应基因mRNA 的效果［8］。

本研究中构建了siRNA 真核表达载体，其转录产物可在体内形成一个9个碱基组成的茎环分离的具有反向重复序列的发夹样RNA（shRNA），此shRNA 被真核细胞内的核酸酶切割成siRNA，进而降解目的基因mRNA 的表达。这种方法克服了人工合成的siRNA 成本高、需要直接操作RNA 以及siRNA 在体内作用时间短等缺点［9］。本研究针对MK 基因序列，设计合成了siRNA 通过转染技术，将MK siRNA 转染入人A549细胞中，分别采用了RT-PCR 和Western blot法检测MK mRNA 和蛋白的表达。发现转染人MK siRNA 的细胞MK mRNA 和蛋白表达水平明显下降，说明转染成功。

接着，本研究观察了MK siRNA 转染对A549细胞凋亡的影响。MK 基因的表达与多种肿瘤细胞凋亡呈正相关，MK 表达上升或下降后细胞凋亡随之增强或减弱［10-11］。通过流式细胞仪检测3 组细胞的细胞凋亡情况，可以清楚地看出，转染MK siRNA 的A549 细胞凋亡率明显增加，提示MK 基因在A549细胞中对细胞凋亡有着重要的作用。实验组细胞caspase-3活性明显高于阴性对照组和空白对照组，提示中期因子可能参与抑制细胞caspase-3活性来抑制A549细胞的凋亡。结果显示：MK 基因表达的下调可以增加A549肿瘤细胞的早期凋亡，为肺癌的治疗提供实验基础。

由于MK 在基因水平和蛋白水平表达的下调，可以预见其在血浆中的水平也会相应降低，所以MK 可以作为一个新的肿瘤标志物应用于临床诊断和预后判断。

［1］ Wilson JF.Liver cancer on the rise［J］.Ann Intern Med，2009，142：1029-1032.

［2］ 张曙光，张林.Midkine基因在肿瘤治疗中的研究进展［J］.现代肿瘤医学，2011，19（8）：1681-1682.

［3］ Ye C，Qi M，Fan QW，et al.Expression of midkine in the early stage of carcinogenesis in human colorectal cancer［J］.Br J Cancer，1999，79（1）：179-184.

［4］ Koide N，Hada H，Shinji T，et al.Expression of the midkine gene in human hepatocellular carcinomas［J］.Hepatogastroenterology，2000，46（30）：3189-3196.

［5］ Kato H，Watanabe K，Murari M，et al.Midkine expression in Reed-Sternberg cells of Hodgkin′s disease［J］.Leuk Lymphoma，2000，37（3／4）：415-424.

［6］ 栾兆吉，褚兰艳.中期因子在肺癌中的研究进展［J］.国际呼吸杂志，2010，30（4）：229-233.

［7］ 蓝美锐，陈礼刚，李涛.中期因子与肿瘤的联系［J］.吉林医学，2013，34（3）：533-534.

［8］ Green DW，Roh H，Pippin J，et al.Antisense oligonucle-otides：an evolving technology for the modulation of gene expression in human disease［J］.J Am Coll Surg，2000，191（1）：93-105.

［9］ Kitabwalla M，Ruprecht RM.RNA interference--a new weapon against HIV and beyond［J］.N Engl J Med，2002，347（17）：1364-1367.

［10］ Tong Y，Mentlein R，Buhl R，et al.Overexpression of midkine contributes to anti-apoptotic effects in human meningiomas［J］.J Neurochem，2007，100（4）：1097-1107.

［11］ Takei Y，Kadomatsu K，Goto T，et al.Combinational antitumor effect of siRNA against midkine and paclitaxel on growth of human prostate cancer xenografts［J］.Cancer，2006，107（4）：864-873.