健脾化湿颗粒对D-IBS大鼠模型CGRP表达的影响＊

付聪敏，王 烨，王迎寒，刘玉玲，张晓峰，东岫岩，郭洪杰

（1.承德护理职业学院涉外护理系；2.河北省重要研究与开发重点实验室；3.承德医学院附属肛肠医院中医内科，河北承德067000）

肠易激综合征（irritable bowel syndrome，IBS）是一种以腹痛、腹部不适，并伴有排便习惯和（或）大便性状异常为主要临床表现的慢性肠功能紊乱性疾病，在中国以腹泻型IBS（DIBS）较多见。由于本病反复发作或慢性迁延，对患者学习、工作和生活产生严重影响，给患者带来了沉重的经济压力和思想负担。流行病学调查显示，IBS患病率为15%～22%，每年约有500万人因此病而就诊，年消耗医疗费80亿美元［1］。国内学者调查显示，广州市居民IBS的患病率为5.6%，普通内科门诊及消化专科门诊中IBS 所占比例分别为10.1%、34.3%［2］。且国内患病率呈逐年上升趋势，已引起广泛重视。迄今为止，IBS的病因及发病机制尚不完全清楚，多数学者认为其病因主要与遗传因素、食物、炎症及精神心理因素有关，其发病机制主要与内脏高敏感、肠道动力异常、脑-肠轴、脑-肠肽等有关。治疗方面，目前尚无特效疗法，主要采用对症治疗［3-5］，但易反复，远期效果不理想。近年来，中医药在D-IBS的治疗上积累了丰富的经验。本实验通过探讨健脾化湿颗粒对D-IBS大鼠模型降钙素基因相关肽（calcilonin gene-related peptide，CGRP）表达的影响，为该药物的临床应用提供理论及实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料 实验动物：Wistar大鼠60只，雌雄各半，6周龄，体质量（170±20）g，动物合格证编号：SCXK（冀）2014-0004，由河北省实验动物中心提供。60只大鼠分成6笼，雌雄分笼，常规饲养。适应性喂养7d后进入实验阶段。实验药物：（1）造模用药，番泻叶（批号为20140420）购自安国市京兴药业有限责任公司，浓煎成生药0.6g／mL 的药液。（2）治疗用药，阳性对照组用匹维溴铵片（得舒特），50 mg，法国苏威制药公司生产，产品批号为624065，碾碎后用蒸馏水配制成3.0 mg／mL的药液。（3）健脾化湿颗粒，由炙黄芪、茯苓、砂仁、益智仁、炒白芍等10味组成，按比例采用现代制剂工艺制成。实验试剂：CGRP免疫组化试剂盒（规格为0.1mL，批号为20140716），购自德国博士德生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 动物分组及建模 将60只大鼠分成对照组（n＝10）和造模组（n＝50），再将造模组大鼠分为5组：模型组、阳性对照组及健脾化湿颗粒低、中、高剂量组（低剂量治疗组、中剂量治疗组、高剂量治疗组），每组10只。每组大鼠雌雄各半，雌雄分笼。建立D-IBS大鼠模型：采用乔氏造模法建立D-IBS大鼠模型［6］。实验前10h禁食，自由饮水。造模组大鼠于上午8：00分别给予番泻叶煎剂（生药0.6g／mL）灌胃，灌胃剂量按10 mL／kg计算，在灌服完番泻叶煎剂后1h，用粗制棉绳束缚大鼠的后两肢，使之行动不便，烦躁不安，造成一定的应激刺激，每次持续2h，每日1次，连续2周。对照组大鼠全程只给予生理盐水灌胃（10mL／kg）。以稀便级判断造模是否成功。

1.2.2 给药方法 对照组大鼠不施加任何处理因素；其他各组于每天上午8：00用药，每天1次，连续2周。模型组大鼠给予生理盐水灌胃，阳性对照组大鼠给予得舒特溶液（3.0 mg／mL）灌胃，高、中、低剂量治疗组大鼠分别给予健脾化湿颗粒药液4.0、2.5、1.5g／mL灌胃，灌胃剂量均按10mL／kg计算。

1.2.3 标本采集和处理 治疗2周后停止用药，用代谢笼测每组大鼠稀便级。禁食、禁水12h后，各组大鼠均以4%水合氯醛麻醉（0.5mL／100g），沿腹腔矢状线切开后，沿肠系膜剪开，留取小肠组织1段（长度为1.0cm），以生理盐水冲洗肠内容物后，将标本放于10%中性甲醛的小瓶内固定24h，常规脱水，石蜡包埋。

1.2.4 观察指标 稀便级：Ⅰ级为粪便滤纸范围直径小于1.0 cm；Ⅱ级为粪便滤纸范围直径1.0～＜2.0cm；Ⅲ级为粪便滤纸范围直径2.0～3.0cm；Ⅳ级为粪便滤纸范围直径大于3.0 cm。粪便滤纸范围为椭圆形者，按其长径计算。

1.2.5 采用免疫组化法检测CGRP 水平 严格按试剂盒说明进行检测。使用医学图像定量分析软件分析小肠黏膜中CGRP阳性面积，每组大鼠随机选取6张切片，每张切片随机分析5个视野。于400倍视野下摄取切片图像，随机选定摄取图像的黏膜层、黏膜下层，全视野测量，得出免疫组化图像中CGRP阳性面积。光镜下见细胞质染成棕黄色者即为CGRP阳性细胞。

1.3 统计学处理 采用SPSS17.0统计软件进行分析，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK 法，检验水准α＝0.05，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠稀便级比较 药物治疗前1d：造模组大鼠稀便级数明显增加，与对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.05），提示D-IBS造模成功。药物治疗2周后：各治疗组大鼠稀便级数明显下降，与模型组比较，差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。

表1 各组大鼠治疗前后稀便级比较（±s，n＝10，cm）

表1 各组大鼠治疗前后稀便级比较（±s，n＝10，cm）

a：P＜0.05，与对照组比较；b：P＜0.05，与模型组比较。

组别 治疗前1d 治疗2周后对照组0.11±0.09 0.14±0.11模型组 3.47±0.12a 4.41±0.20a阳性对照组 3.61±0.21a 2.82±0.18ab低剂量治疗组 3.51±0.19a 3.42±0.16ab中剂量治疗组 3.37±0.20a 2.78±0.14ab高剂量治疗组 3.36±0.18a 1.81±0.15 ab

图1 各组大鼠小肠黏膜CGRP阳性表达情况（×400）

2.2 各组大鼠小肠黏膜CGRP 表达比较 与对照组大鼠小肠黏膜CGRP阳性面积（0.043 17±0.002 78）比较，模型组降低（0.019 17±0.003 63，P＜0.01）；与模型组比较，各治疗组CGRP阳性面积增高（P＜0.05）；与阳性对照组（0.038 52±0.002 37）比较，健脾化湿颗粒低、中剂量治疗组CGRP阳性面积降低（0.0231 67±0.002 86、0.033 33±0.002 80，P＜0.05），而与健脾化湿颗粒高剂量治疗组（0.037 18±0.001 41）比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见图1。

3 讨 论

健脾化湿颗粒源于上海市名中医马贵同教授经验方，该药以前采用中药传统剂型-汤剂，临床应用多年，对D-IBS患者有很好的疗效。现经水低温动态提取、冰冻浓缩和干法制粒等方法制成颗粒剂，是古方与现代提取工艺、制剂工艺和药理研究方法相结合的产物［7］。经实验研究发现，低温动态提取、冰冻浓缩的过程对中药药效的影响不大，与健脾化湿汤无差异［8］。且在治疗D-IBS的实验研究上取得了一定的成果［9］。

近年来研究发现，脑-肠互动在D-IBS发病机制中的作用日益被认识［10］。CGRP 是一种含有37 个氨基酸残基的脑肠肽，广泛分布于中枢和外周神经系统，特别是感觉神经元胞体和末梢以及胃肠道壁内神经丛，具有调节胃肠血流、胃肠分泌及运动功能。有动物实验研究发现，IBS模型大鼠血浆及结肠黏膜CGRP水平下降，提示CGRP 与IBS发病有关［11］。由于CGRP水平下降，导致胃肠道平滑肌收缩作用增强，血管舒张抑制，进而肠道血流量减少，温煦肠壁作用下降，这可能是IBS模型大鼠腹痛、腹泻的主要原因之一。牛庆慧等［12］研究发现，D-IBS患者回盲部和乙状结肠部位的肠黏膜CGRP 阳性神经肽纤维强度较对照组高，而IBS其他分型与对照组无明显差异。有研究发现，CGRP与神经类物质共同作用致老鼠肠道敏感性增高［13］，提示CGRP 可能参与了IBS 的病理生理过程。Kaur等［14］发现CGRP在生理情况下并不发挥作用，只在受到刺激或疾病状态下释放增多。吴皓萌等［15］发现CGRP 与DIBS的肝郁脾虚证、脾胃虚弱证呈正相关。CGRP 是促炎症性感觉性神经肽，可引起结肠动脉的舒张，加快结肠的蠕动，导致腹痛、肠鸣、腹泻。本实验研究发现，模型组大鼠小肠黏膜CGRP水平显著下降，而各治疗组大鼠血清CGRP 明显升高，其中以健脾化湿颗粒高剂量组最明显，提示CGRP 参与了DIBS的病理生理过程。

健脾化湿颗粒对D-IBS有很好的治疗作用，高剂量组优于中、低剂量组，其作用机制可能是通过提高局部肠组织中CGRP水平而达到治疗目的。

［1］ Longstreth GF，Drossman DA.Severe irritable bowel and functional abdominal pain syndromes：managing the patientand health care cos［J］.Clin Gastroenterol Hepatol，2005，3（4）：397-400.

［2］ 熊理守，陈旻湖，陈惠新，等.广东省社区人群肠易激综合征的流行病学研究［J］.中华医学杂志，2004，84（4）：18-21.

［3］ 崔立红，杨云生.功能性胃肠疾病研究现状与展望［J］.山东医药，2009，49（28）：109-110.

［4］ 汤莉，孙一芬.奥体溴安联合四联活菌治疗腹泻型肠易激综合征的临床观察［J］.中国实用内科杂志，2007，27（12）：54-57.

［5］ 李宇，史维.肠易激综合征研究现状［J］.四川医学，2006，27（8）：785-787.

［6］ 乔明崎.肝气逆.肝气郁两证客观指标实验研究［J］.山东中医学院学报，1992，22（3）：23-26.

［7］ 王迎寒.健脾化湿颗粒治疗脾虚型肠易激综合征的机制研究［D］.承德：承德医学院中药研究所，2007.

［8］ 王迎寒，张晓峰.健脾化湿水提液干粉冰冻液及汤剂的药效学比较［J］.辽宁中医杂志，2009，36（4）：603-604.

［9］ 王迎寒，陈光晖，刘玉玲.健脾化湿颗粒对IBS模型大鼠结肠NO 和NOS的 影 响［J］.承 德 医 学 院 学 报，2010，27（2）：129-131.

［10］ 王伟岸，钱家鸣，潘国宗.肠易激综合征的发病机制［J］.胃肠病学和肝病学杂志，2001，10（2）：99-102.

［11］ 王垂杰，赵文娟，玉锋.痛泻要方对肠易激综合征大鼠血浆及肠黏膜CGRP影响的实验研究［J］.生命科学仪器，2009，10（7）：24-26.

［12］ 牛庆慧，张翠萍，鞠辉.肠道黏膜肥大细胞和降钙素基冈相关肽在肠易激综合征中的表达［J］.世界华人消化杂志，2009，17（2）：213-217.

［13］ Delafoy L，Gelot A，Ardid D.Interactive involvement of brain derived neurotrophic factor，nerve growth factor，and calcitonin gene related peptide in colonic hypersensitivity in the rat［J］.Gut，2006，55（7）：940-945.

［14］ Kaur R，OShaughnessy CT，Jarvie EM，et a1.Characterization of a calcitonin gene-related peptide release∞say in rat isolated distal colon［J］.Arch Pharm Res，2009，32（12）：1775-178.

［15］ 吴皓萌，徐志伟，敖海清等.腹泻型肠易激综合征中医证候与血清脑肠肽水平变化的相关性研究［J］.中华中医药杂志，2014，29（5）：1429-1433.