玻璃化冻融胚胎移植妊娠结局的影响因素分析

张 静 吕 睿 吕永焕 宋学茹 赵晓徽 白晓红

天津医科大学总医院妇产科生殖中心（300052）

自1983年世界上首例冻融胚胎移植（FET）获得成功妊娠以来，冻融胚胎移植现已广泛应用于人类辅助生殖技术领域。FET在预防严重卵巢过度刺激综合征（OHSS）的发生，提高累积妊娠率，减少多胎妊娠，减少多次促排卵给患者带来的痛苦和减轻患者的经济负担等方面具有重要意义。影响FET妊娠结局的因素很多，但如何提高FET的临床妊娠率一直是生殖领域所关注的问题。玻璃化冻融胚胎技术与程序化技术相比操作简便、冷冻复苏效果好、胚胎植入率和临床妊娠率高［1］。本研究通过回顾性分析本中心247个FET周期的临床资料，探讨FET妊娠结局的影响因素。

1 资料与方法

1.1 资料来源

选取2013年1月～2014年1月在天津医科大学总医院生殖中心接受FET的患者临床资料，共计247个FET周期，患者年龄23～45（32.2±4.4）岁。

1.2 胚胎冷冻选择标准

细胞数目发育正常［第2天（D2）发育到2～5细胞，第3天（D3）发育到7～9细胞］，卵裂球均匀或稍不均匀，碎片＜25%予以冷冻，在患者知情同意下少量非优质胚胎也予以冷冻。

1.3 胚胎玻璃化冻融方法

1.3.1 冻融液准备 冷冻A液（HS）：由杜氏磷酸缓冲液（DPBS）、20%人血清白蛋白（HAS）、10%二甲基亚砜（DMSO）、10%乙二醇（EG）构成。冷冻B液（VS）：由 DPBS、20%HSA、20%DMSO、20%EG、0.4M蔗糖构成。解冻液1：含1M蔗糖的DPBS。解冻液2：含0.25M 蔗糖的DPBS。解冻液3：含0.125M 的 DPBS。解冻液 4：含 20%HSA 的DPBS。

1.3.2 冷冻 冷冻载体选用日本加藤载杆。室温下将1～3个胚胎放入HS中4min，平衡结束后将胚胎放在VS中轻轻吹吸数次，在30s内将胚胎放在冷冻载体前端标记的位置，确认胚胎在载体上后迅速投入液氮，再在液氮内完成装杆过程。

1.3.3 解冻 从液氮中取出冷冻管，确认信息正确无误后，将胚胎快速移入37℃解冻液1中5min，依次移入解冻液2中2～3min，解冻液3中1～2min，解冻液4中1min，胚胎存活后转入含胚胎胶的移植皿中待移植。

1.4 内膜准备

根据患者既往月经周期和排卵情况选择自然周期、人工周期或者促排卵周期进行子宫内膜准备。①自然周期组：既往月经规律有排卵者，B超检测卵泡发育及内膜厚度及形态，当优势卵泡直径达到18mm时，可予以人绒毛膜促性腺激素（hCG）6000～8000U诱导排卵，B超监测排卵日期，排卵后予以孕激素40～80mg／d促使子宫内膜向分泌期转化，根据冻胚时间决定移植时间。②人工周期组：适用于月经不规律，排卵障碍或既往监测内膜偏薄的患者。常用戊酸雌二醇3mg，每日2次，7d后B超检测内膜厚度及评价生长速度，根据情况调整用量，B超监测内膜厚度6～8mm时予以孕激素40～80 mg／d转化内膜，根据冻胚时间决定移植时间。③促排卵周期组：适用于不排卵或者排卵不规律者，月经第3天予以尿促性素（HMG）促排卵，适当调整用量，当优势卵泡直径达到18mm时，予以hCG诱发排卵，排卵后予以孕激素40～80mg／d转化内膜，根据冻胚时间决定移植时间。移植后继续予以孕激素60～80mg／d黄体支持治疗。本研究对于内膜过厚（＞18mm）或者太薄（＜6.5mm）者，经多方面评估取消此次周期。

1.5 移植胚胎数目

2013年上半年移植3个胚胎的共68例，为降低多胎的发生，下半年仅移植2个胚胎，对于既往冷冻≥3个的胚胎解冻后，在患者知情同意下选择较好的2个移植，剩余的进行体外培养观察，如有囊胚形成，再予以冷冻。

1.6 妊娠判断

移植后2周测定尿和血β-hCG，移植后4周，B超检查见妊娠囊确定为临床妊娠。根据临床妊娠结局分为妊娠组（112例）和非妊娠组（135例）。

1.7 统计学处理

采用SPSS17.0进行logistic多因素回归分析，计量资料采用t检验，计数资料采用χ2检验，筛选出有统计学意义的因素，检验水准α＝0.05。

2 结果

2.1 一般资料

胚胎总复苏率为96.5%（574／595），周期取消率为0（0／247）。妊娠组和非妊娠组胚胎复苏率分别为97.7%（260／266）和95.4%（314／329），差异无统计学意义（P＞0.05）。D2和D3胚胎复苏率分别为94.0%（189／201）和97.2%（383／394），差异无统计学意义（P＞0.05）。FET 临床妊娠率为45.3%（112／247）。移植3枚、2枚和1枚胚胎的多胎率分别为40.0%（12／30）、31.3%（25／80）和0，其中3胎率分别为13.33%（4／30）和1.25%（1／80）。

2.2 妊娠结局影响因素的logistic多因素分析

移植日子宫内膜厚度和冻胚时间与FET的妊娠结局有关。移植日子宫内膜厚度3组比较差异具有统计学意义，经两两比较χ2检验内膜厚度＞11.0mm的妊娠率高于其他两组（P＜0.05），而内膜厚度＜8.0mm 与8.0～11.0mm 者妊娠率相比，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1和表2。

表1 FET影响因素分析

表2 妊娠结局影响因素的logistic回归分析

3 讨论

3.1 子宫内膜厚度与FET妊娠结局的关系

子宫内膜的容受性即子宫内膜对胚胎的接受能力，是特定时期的一种状态，即着床窗口期，是FET能否获得成功临床妊娠的关键因素之一。胚胎着床必须具备的条件之一是胚胎与子宫内膜同步发育且功能协调。子宫内膜厚度是评价子宫内膜容受性的一项重要指标，然而子宫内膜厚度的差异和FET妊娠结局的关系目前尚无统一观点。有研究认为不同子宫内膜厚度之间的临床妊娠率无明显差异［2］。而邓朝晖等［3］的研究发现子宫内膜厚度＜8mm显著低于≥8mm的种植率及临床妊娠率。秘祖霞等［4］则研究发现FET日子宫内膜厚度＞12.0mm与≤12.0mm相比胚胎着床率和临床妊娠率更高。有学者则认为子宫内膜厚度与妊娠率成正相关，随着移植日子宫内膜的增厚，妊娠率随之提高［5］。而有研究认为胚胎着床需要适宜的子宫内膜厚度，子宫内膜太薄或者太厚均不利于胚胎着床，子宫内膜厚度在8.0～11.0mm 内妊娠率最高［6］，而宋梦玲等［7］研究发现FET日子宫内膜厚度在9～14mm的临床妊娠率最高。本研究数据则显示移植日子宫内膜厚度在6.5～18mm 范围内，＜8.0mm 和8.0～11.0mm与＞11.0mm相比均为＞11.0mm临床妊娠率更高，而子宫内膜厚度在8.0～11.0mm与＜8.0mm相比虽然临床妊娠率有一定的提高，但差异无统计学意义。因此FET日子宫内膜厚度＞11.0mm的妊娠率更高，提示子宫内膜厚度是影响FET妊娠结局的关键因素，临床上对子宫内膜厚度的调控具有重要意义。

3.2 冻胚时间与FET妊娠结局的关系

目前大多数生殖中心都倾向于选择D3进行胚胎移植或冷冻，从而期望能够获得更高的临床妊娠率，但有时也需要根据具体情况选择在D2移植和冷冻胚胎，然而D2胚胎和D3胚胎的复苏率和妊娠率哪个更高观点不一。有研究认为D2胚胎和D3胚胎的复苏率、临床妊娠率均无明显差异［8］。而Salumets等［9］研究则认为D3胚胎比D2胚胎具有更高的复苏率，但两者的临床妊娠率无明显差异。唐永梅等［10］则发现D2胚胎比D3胚胎复苏率和临床妊娠率更高。有研究则认为D3胚胎与D2胚胎相比复苏率较低但临床妊娠率却升高，这可能与D3胚胎正向桑椹期胚胎转化，细胞代谢旺盛，细胞发生融合，冷冻耐受性差，而复苏后存活的D3胚胎发育能力强，易于着床有关［11］。本研究结果显示FET D3与D2胚胎的冷冻后复苏率分别为94.0%和97%，差异无统计学意义，但临床妊娠率却升高（59.7%和39.4%），与之前 Sifer等［12］的研究结果一致。D3胚胎多为7～9细胞，此时胚胎发育潜能高，着床能力强，而胚胎从4细胞到8细胞即D2到D3发育过程中可出现发育停滞或者质量下降，可能与其在发育过程中启动了异常淘汰和自我筛选的能力有关。因此如果患者的胚胎数目多、质量高，则建议其等待胚胎发育到D3再移植和冷冻，使胚胎经过发育停滞期，过滤掉那些低质量的胚胎，筛选出高质量的胚胎，从而提高临床妊娠率。当然如果患者的胚胎数目少或者质量比较差，则建议其选择D2胚胎移植或者冷冻，可以获得一定数目的胚胎移植或者冷冻，从而避免在体外发育时间过长没有优质胚胎，导致此周期无可移植的胚胎。

3.3 其他影响因素与FET妊娠结局的关系

本研究结果显示胚胎质量、移植胚胎数目、孕妇年龄、子宫内膜准备方案、受精方式和FET次数均与FET妊娠结局无关。较好的临床妊娠结局是在保证临床妊娠率的同时减少胚胎移植数目，从而降低多胎妊娠的发生，有研究认为移植胚胎数目以2个最为适宜［13］。本研究结果显示移植1个、2个和3个胚胎的妊娠率比较无统计学差异，移植2个和3个胚胎的多胎妊娠率亦无统计学差异。移植2个胚胎可以最大程度地避免胚胎资源的浪费，增加胚胎冷冻的机会，从而提高累积妊娠率。移植3个胚胎时三胎率增加，若患者为三胎妊娠，则必须承受减胎所带来的痛苦和风险，因此本中心现以移植2个胚胎为标准。随着辅助生殖技术的日益发展，胚胎种植率随之提高，单胚胎冷冻和单胚胎移植成为一种趋势。

3.4 多因素回归分析

玻璃化FET的影响因素很多，在logistic多因素回归分析中，移植日子宫内膜厚度和冻胚时间起关键作用。因此为提高FET的妊娠率，临床上对上述2个关键影响因素的调控具有重要意义，若患者的胚胎数量多，质量高，则尽可能在第3天进行胚胎移植或冷冻，在一定子宫内膜厚度范围内，选择合适的时间（尽可能使子宫内膜厚度达到11mm）转化子宫内膜和胚胎移植。

玻璃化冷冻技术的复苏率高，能更大程度地保持胚胎的发育潜能，是提高累积妊娠率的重要手段，为单胚胎移植和单胚胎冷冻提供了有力的技术支持。在胚胎冷冻和FET中，优化和处理相关影响因素，更有助于提高玻璃化FET的妊娠率。

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