干扰素α通过IFI16和P21影响人血管内皮细胞凋亡＊

龙向淑，吴 强，宋 方，黄 晶，田茂波，肖 燕

（贵州省人民医院心血管内科，贵阳550002）

血管内皮细胞（vascular endothelial cells，VECs）连续内衬于血管腔表面而构成的血管内皮具有物理屏障作用及内分泌等功能。各种物理、化学及炎症等因素导致血管内皮细胞过度凋亡、增殖减少及功能紊乱是高血压、动脉粥样硬化及血管成形术后再狭窄等血管增殖性疾病发生的始动环节，因此，抑制VECs凋亡并适当促进其增殖对防治上述疾病至关重要。国外研究显示，干扰素（interferon，IFN）可诱导多种肿瘤细胞凋亡［1-4］。国内研究表明，干扰素α（IFN-α）可抑制大鼠血管平滑肌细胞及人VECs增殖［5-6］，但IFN-α对VECs凋亡的影响及其机制尚未完全明确。本研究拟观察IFN-α对人VECs凋亡的影响及IFN 诱导蛋白16基因（IFI16）和P21表达变化，初步探讨IFN-α影响人VECs凋亡的部分机制，为防治上述心血管疾病提供新的依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 人脐静脉内皮细胞株ECV304购自中科院。IFN-α购自北京三元基因工程有限公司。LipofectamineTM2000Reagent购自Invitrogen公司。2×Taq PCR MasterMix（KT201）、Trizol总RNA 提取试剂盒及DNA Ladder（100bp）购自北京天根公司。RT-PCR 试剂盒（DRR047A）购自TaKa-Ra公司。PCR 引物设计及合成由宝生物工程（大连）有限公司完成。引物具体序列如下。IFI16，上游：5′-AGG ACC GTT CAT GAC CAG ZAT AG-3′，下 游：5′-TGC GTT CAG CAC CAT CAC TTC-3′（扩增长度184bp）；GAPDH，上游：5′-ACC ACA GTC CAT GCC ATC AC-3′，下 游：5′-TCC ACC ACC CTG TTG CTG TA-3′（扩增长度452bp）；P21，上游：5′-AAG ACC ATG TGG ACC TGT CAC TGT-3′，下游：5′-GAA GAT CAG CCG GCG TTT-3′（扩增长度155bp）。IFI16siRNA（h）：sc-35633、Control siRNA-A（sc-36869）及IFI16 抗 体（sc-8023）购自Santa Cruz公司。P21抗体（ab92675）购自Abcam公司。Tubulin抗体（AT819）及Annexin V-FITC 细胞凋亡检测试剂盒（C1063）购自碧云天公司。

1.2 方法

1.2.1 VECs培养及实验分组 实验细胞为复苏后第2～3代处于对数生长期的VECs。实验分3组：转染非特异性siRNA 设为阴性对照组（对照组），IFN-α诱导加非特异性siRNA转 染组（IFN 组）和IFN-α诱 导 加IFI16siRNA 转 染 组（IFN＋siRNA 组）。IFN 组及IFN＋siRNA 组加入IFN-α干预6h后去除IFN-α（IFN-α干预终浓度为2×106U／L），再分别转染非特异性siRNA 及IFI16siRNA，对照组未加入IFN-α，与上述两组同步转染非特异性siRNA，培养48h收集细胞。实验重复3次。

1.2.2 反转录PCR（RT-PCR）测定mRNA 表达 Trizol法提取细胞总RNA。取总RNA 1μL 为模板，逆转录合成cDNA。再以cDNA 产物3μL 为模板，进行PCR 反应，反应体系25 μL，扩增条件：94 ℃预变 性3 min后，94 ℃30s、58 ℃30s、72 ℃1min，共30个循环，最后72℃延伸5min。PCR 反应结束后取产物5μL 进行电泳分析，电泳介质为2%琼脂糖凝胶，电泳结束在UVP800型凝胶成像系统下观察DNA 电泳结果并成像。

1.2.3 蛋白印迹法（Western blot）测定蛋白表达 收集分组干预培养于6孔板中的VECs至5mL EP 管中，1 000r／min离心5min，吸尽培养液，PBS漂洗细胞3次并转移至1.5mL的EP管中，2 000r／min离心5min，去除PBS，予细胞裂解液裂解细胞，高速冷冻（4 ℃）离心5min，取适量上清液另置于预冷、无菌的EP管中，采用BCA 法行蛋白定量。向0.2mL EP管中加入80μg蛋白样品，取十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）蛋白上样缓冲液适量加入管中，沸水（100℃）中煮沸3min。以8% SDS-PAGE 为电泳介质，恒压80～100V 分离蛋白，4℃恒流250mA×90min转移蛋白至PVDF膜上。转印蛋白后的PVDF 膜置入含5%脱脂奶粉的TBST中封闭2h，去除封闭液，加入按1∶500稀释的一抗，4 ℃孵育过夜，TBST 漂洗3次，吸尽TBST，加入按1∶5 000稀释的二抗（辣根过氧化物酶标记），摇床孵育2h（常温），收集二抗，TBST 摇床漂洗3次。将PVDF膜蛋白面朝上置于保鲜膜上，取ECL化学发光试剂A 和B按1∶1避光混合，1min后将混合液均匀滴加至膜上，约1 min 后去尽残液，保鲜膜固定PVDF膜。X 光胶片曝光、显影及定影后扫描，用图像软件根据信号强弱对条带进行灰度分析。

1.2.4 流式细胞术检测细胞凋亡 收集培养于6孔板中的各组细胞，1 000r／min离心5min，PBS漂洗2次，按Annexin VFITC细胞凋亡试剂盒说明书操作，置流式细胞仪测定每个样本中细胞凋亡的百分比。

1.3 统计学处理 采用SPSS11.5 软件进行统计学分析处理，计量数据用±s表示，LSD 法组间两两比较。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 干预因素对IFI16mRNA 及蛋白表达的影响 与对照组比较，IFN-α干预后IFI16mRNA 及蛋白表达增多（P＜0.05），IFN-α干预后再转染IFI16siRNA，IFI16 mRNA 和蛋白表达减少（P＜0.05）；与IFN 组比较，IFN＋siRNA 组IFI16mRNA和蛋白表达下调（P＜0.05），见图1、表1。

2.2 干预因素对P21mRNA 及蛋白表达的影响 与对照组比较，IFN-α干预后P21mRNA 及蛋白表达增多（P＜0.05），IFN-α干预后再转染IFI16siRNA，P21mRNA 及蛋白表达减少（P＜0.05）；与IFN 组比较，IFN＋siRNA 组P21mRNA 及蛋白表达下调（P＜0.05），见图2、表1。

图1 干预因素对VECs IFI16mRNA 和蛋白表达的影响

图2 干预因素对VECs P21mRNA 和蛋白表达的影响

图3 干预因素对VECs凋亡的影响

表1 干预因素对相关指标的影响（±s，n＝3）

表1 干预因素对相关指标的影响（±s，n＝3）

＊：P＜0.05，与对照组比较；△：P＜0.05，与IFN 组比较。

组别 IFI16mRNA IFI16蛋白 P21mRNA P21蛋白 细胞凋亡率（%）对照组 0.97±0.08 1.25±0.06 0.51±0.07 0.47±0.06 10.27±2.09 IFN 组 1.89±0.05＊ 1.92±0.08＊ 1.37±0.09＊ 0.81±0.04＊ 23.26±1.39＊IFN＋siRNA 组 0.23±0.06＊△ 0.31±0.04＊△ 0.11±0.05＊△ 0.19±0.07＊△ 5.04±1.51＊△

2.3 干预因素对VECs凋亡的影响 与对照组比较，IFN 组VECs凋亡增多（P＜0.05），IFN＋siRNA 组VECs凋亡减少（P＜0.05）；与IFN 组比较，IFN＋siRNA 组VECs凋亡减少（P＜0.05），见图3、表1。

3 讨 论

VECs构成的血管内皮是分布于全身各组织的代谢十分活跃的一个内分泌器官，具有调节血管平滑肌细胞增殖、迁移、表型转化及基质分泌等生物学功能，是血液与组织之间的物理屏障。物理损伤、化学刺激、炎性反应等因素可引起内皮细胞凋亡、脱落，导致血管内皮损伤、内分泌功能障碍及内皮细胞增殖活性改变，是血管增殖性疾病发生、发展过程中重要的病理基础。如何维持血管内皮完整性并使其内分泌功能正常化是血管增殖性疾病防治领域有待攻克的难题。

IFN 是一组具有免疫调节、抗病毒及影响细胞增殖和凋亡等作用的细胞因子家族［7-8］。IFN 通过影响细胞基因表达、跨膜信号传递、蛋白激酶激活及蛋白磷酸化等而促进细胞凋亡［2-3，8］。IFI16是IFN诱导蛋白200家族的人类蛋白成员之一。众多研究表明，IFI16具有抗肿瘤、抗病毒、调节免疫、抑制VECs增殖、迁移及新生血管形成和调控血管内皮炎性反应等作用［9-14］。近期研究显示，IFN-α可促进IFI16表达并抑制VECs增殖［6］，但IFN-α对VECs凋亡有何影响？本研究结果显示，IFN-α干预后IFI16mRNA 和蛋白表达上调，导致VECs凋亡增加，进一步证实IFI16表达存在转录和翻译水平的IFNα诱导性，提示IFN-α可诱导IFI16 表达而促进VECs凋亡。P21作为细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子（cyclin dependent kinase inhibitors，CDKI）的CIP 家族成员之一，具有抑制细胞增殖、调控细胞终末分化和衰老等作用。P21是P53调节转录的靶基因，P53与其启动子上的P53结合位点结合而调节靶基因表达，P21表达除受P53调节外，非P53依赖信号通路如信号转导子及转录激活子（signal transducer and activator of transcription，STAT）及P200家族成员P202等亦可调节其表达［5］。P53能促进细胞凋亡相关分子，如Apaf-1、Bax、Noxa和PUMA 等的表达，增强细胞对凋亡刺激的敏感性而导致细胞凋亡［15］。本研究结果显示，单独IFN-α干预后，IFI16 mRNA和蛋白上调，VECs凋亡增多，伴P21mRNA 和蛋白表达上调；IFN-α干预后再转染IFI16siRNA，IFI16 mRNA 和蛋白表达下调，细胞凋亡减少，P21 mRNA 和蛋白表达亦减少，证实IFI16siRNA 在转录和翻译水平对IFI16表达的抑制作用，提示IFI16和P21表达变化呈一致性趋势，在IFN-α促进VECs凋亡过程中，P21可能作为IFI16的下游蛋白而发挥其作用。

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