槲皮素对结肠癌SW480细胞增殖及蛋白表达的影响

王　芬,熊　玲

(湖北医药学院附属人民医院消化内科,湖北 十堰 442000)

槲皮素对结肠癌SW480细胞增殖及蛋白表达的影响

王芬,熊玲※

(湖北医药学院附属人民医院消化内科,湖北 十堰 442000)

随着现代生活压力的增大、饮食结构和习惯的改变，结肠癌发病率正呈逐年增高的趋势，尽管目前在该病的诊断和治疗方面都有不同程度的进展，但总体来说，患者的生存率及生活质量并无根本改观[1-2]。化疗药物是一把“双刃剑”，在抑制癌细胞的同时，其不良反应亦会明显出现，且临床发现结肠癌患者多数对化疗药物不敏感，治疗效果差，预后不理想[3]。因此，探索灵敏度高、不良反应小、新剂型的抗结肠癌药物已成为该领域的热门课题[4]。基于天然产物的抗肿瘤药物研发，近年来一直是抗肿瘤药物研发的热点，槲皮素逐渐进入人们的视野。研究表明，槲皮素有明显的抑制肿瘤细胞生长的作用[5]。槲皮素广泛存在于自然界，如水果、蔬菜、谷类作物中，是天然自由基清除剂[6]。前期有关研究证实，槲皮素具有止咳平喘、降压降脂、抗病毒消炎和抗肿瘤等作用[7]。本研究通过观察槲皮素对结肠癌 SW480细胞体外增殖及相关蛋白表达的影响，深入开展槲皮素抗肿瘤活性的物质基础及其分子机制研究，旨在为槲皮素抗结肠癌的临床应用提供理论依据，从而探讨其抗癌机制。

1材料与方法

1.1主要实验材料人结肠癌细胞株 SW480，购于百恩维生物科技有限公司，规格C0021。槲皮素、二甲基亚砜、兔抗人抗体Ki67、鼠抗人抗体均购于华拓生物科技有限公司。Dulbecco′s Modified Eagle Medium(DMEM)培养基及牛血清均购自 Sigma 公司。细胞增殖、细胞毒性检测试剂盒(CCK-8)购于上海翊圣生物科技有限公司，批号：CD0028179。

1.2方法

1.2.1细胞培养将人结肠癌SW480细胞培养于DMEM培养液中，并将细胞培养条件设定在37 ℃，5%二氧化碳，每隔3日用含有0.25% 乙二胺四乙酸的胰酶进行消化(1∶3传代)。收集生长稳定、处于对数生长期的肿瘤细胞(细胞浓度1×108个/L)。将不同浓度的槲皮素(终浓度分别为 10、20、40、80、160 μmol/L) 加入相对应各组细胞干预，另设未进行槲皮素干预的阴性对照组，记录各检测指标。

1.2.2重组基膜侵袭实验根据林增海等[5]重组基膜实验法改良，将DMEM(不含血清)与 Matrigel 以5∶1的配置比例制成R溶液，每孔注入50 μL R溶液，在37 ℃培养箱中放置1 h即得到人工重组基膜。将20% FBS 培养基加入Transwell 小室的下室。取经槲皮素干预的肿瘤细胞将其细胞浓度调整为 1×108个/L，按照每孔100 μL量加到 Transwell 上室中，放入37 ℃、5%二氧化碳的培养箱内培育15 h后，除去Transwell 小室上室中的液体，取出聚碳酸酯滤膜，擦尽膜上剩余液体及残余肿瘤细胞。用甲醇固定1 min，苏木精-伊红染色，200×显微镜下统计穿过聚碳酸酯膜的细胞数。每膜计数随机选取 5 个不同视野 (上、下、左、右、中)。

1.2.3细胞运动能力测定该测定的实验步骤与细胞侵袭能力实验步骤相同，除了聚碳酸酯膜内表面不加用Matrigel。

1.2.4细胞增殖抑制率前期已成功培育出处于对数生长期的结肠癌细胞，取该细胞制成浓度为1×108/L的细胞混悬液，以100 μL/孔的标准注入于96孔板，培养箱孵育条件：37 ℃、5%二氧化碳，在该条件下将细胞孵育24 h后在孔中依次加入浓度分别为10、20、40、80、160 μmol/L的槲皮素并作用48 h，每个浓度需设3个对应孔。将等量的二甲基亚砜设为阴性对照组，并以空白孔调零，经槲皮素干预充分后，每孔加入13 μL CCK-8，待培养3 h后记录吸光度(optical delnsity，OD)值，统计数据并进行分析。细胞增殖抑制率(%)=(1-槲皮素组OD值/阴性对照组OD值)×100%，观察各组细胞的生长抑制情况。

1.2.5Ki67、增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)的表达运用紫外分光光度法测得各组总蛋白浓度，加热变性后进行凝胶电泳，转至聚偏二氟乙烯膜，5%脱脂牛奶室温封闭作用2.5 h后，加兔抗人Ki67及鼠抗人PCNA一抗，在4 ℃条件下经过24 h后加1∶1000稀释的HRP 标记的鼠抗兔及鼠抗羊二抗，室温孵育0.5 h，PBS清洗3次超敏化学发光底物显影。

2结果

2.1槲皮素对SW480细胞侵袭、运动能力的的影响在经浓度为10～160 μmol/L的槲皮素作用72 h后，SW480 细胞体外侵袭能力显著降低，运动能力明显下降，并随药物浓度的增加而更明显。与对照组相比，在槲皮素的质量浓度为40～160 μmol/L 时，它对SW480细胞体外侵袭力及运动能力的差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

槲皮素浓度(mg/L)侵袭率运动穿膜率0100.00100.001070.88±11.2374.04±9.062063.78±8.9765.35±8.134058.33±6.58a60.46±4.08a8053.67±10.02a56.81±6.59a16050.13±7.55a53.69±4.57aF16.43743.213P<0.01<0.01

a与空白对照组(0 mg/L)比较，P<0.05

2.2槲皮素作用于SW480细胞体外增殖抑制的统计分析人结肠癌SW480细胞经不同浓度槲皮素干预72 h后，各组OD值经方差分析显示10～160 mg/L浓度组与空白对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05)，且当槲皮素浓度为160 μmol/L 时，其干预可使SW480细胞增殖抑制率达到最大化，见表2。

槲皮素浓度(mg/L)OD450增殖抑制率(%)01.253±0.1400101.189±0.097a4.10±1.2a200.985±0.036a13.9±1.5a400.632±0.012a38.8±2.2a800.583±0.035a41.5±2.6a1600.520±0.021a45.3±2.6aF54.6299.874P<0.01<0.01

OD ：吸光度；a与空白对照组(0 mg/L)比较，P<0.05

2.3槲皮素对SW480细胞Ki67和PCNA表达的影响在槲皮素浓度为160 μmol/L时，随着槲皮素干预时间的延长，Ki67和PCNA的表达呈下降趋势，其蛋白表达程度在72 h 时达到最低，见图1。

图1　槲皮素干预SW480细胞Ki67、增殖细胞核抗原(PCNA)表达情况

3讨论

从20世纪70 年代至今结肠癌的发病率为(28～37)/万[8]，平均发生率以4.2%的增长率逐年增加[9]，虽然近年来在该病的诊断和治疗方面均有不同程度的进展，但目前仍未找到有效的治疗方法[10-11]。从天然植物中寻找有效的抗癌药物是国内外临床及科研工作者的研究热点，因其具有多靶作用点、不良反应小等诸多优势，目前已成为研究抗肿瘤药物的热门课题[12]。

槲皮素是天然存在的一种黄酮类化合物，它的作用广泛，既往研究发现槲皮素具有清除自由基、抗癌、降压、降脂、扩冠抗心律失常、抗血小板聚集等多种药物作用，对人类肿瘤、衰老、感染、心血管疾病的治疗和预防具有重要意义[13]。在抗肿瘤方面国内外的相关研究在白血病、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌和胶质瘤等方面较多[14]，已知是有效抗癌剂之一，只要达到合适的药物浓度，槲皮素便可直接阻滞肿瘤细胞的增殖[15]。因此，目前在肿瘤的化学预防和治疗作用研究中，槲皮素日益受到人们关注，已然成为抗癌新宠[16]。Tan等[17]发现，槲皮素与重金属螯合后的合成剂能够嵌入肿瘤细胞染色体中，使细胞核皱缩引起细胞凋亡，从而达到抗癌效果。Zhou等[18]发现，槲皮素与铜螯合后能与肿瘤细胞DNA形成相互键合，破坏肿瘤细胞的异常增殖，抑制肿瘤细胞的恶性生长。Ferrer等[19]发现槲皮素钒具有抗骨肿瘤的作用。槲皮素抗肿瘤的确切疗效显示出十分重要的研究及应用价值，且不良反应小，已公认是颇具前景的抗癌药物及癌肿放化疗辅助用药，深入研究其作用机制对临床治疗机药物研发具有极其重要的意义。

从本研究结果可看出，槲皮素在体外的细胞毒作用能抑制结肠癌 SW480 细胞体外增殖，在一定范围内其毒性作用随剂量的增大而抑制增强，呈现正比量效关系。且在槲皮素用药干预后肿瘤细胞的侵袭能力和运动能力具呈下降趋势，说明槲皮素不仅能通过诱导细胞凋亡、加速细胞分化达到抑制细胞增殖的目的，还能影响肿瘤细胞体外侵袭力及运动活性，进而从多方面发挥抗肿瘤的作用，此外，在SW480增殖相关蛋白Ki67和PCNA的表达中发现，在浓度为160 μmol/L槲皮素干预可使SW480细胞增殖抑制率达到最大化，故取用该浓度干预SW480细胞，采用 Western blot 检测蛋白Ki67和PCNA的表达情况。结果显示，槲皮素可使SW480细胞内增殖相关蛋白Ki67和PCNA的表达下降，且在同等浓度下与时间呈正比关系。

总之，槲皮素对结肠癌SW480细胞体外异常增殖具有明显的抑制作用，能影响该肿瘤细胞相关增殖蛋白的表达，它的广泛药用价值值得进一步研究，其抗肿瘤作用可能成为结肠癌药物研究的新导向，具有广阔的应用前景和开发价值。

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继发症继发症(Secondary disease)也称续发症，是指与原发病有明确的因果关系。在原发病的发生、发展过程中，由于机体的统一性、脏器间的相关性、病情扩展、免疫复合物-变态反应以及内环境失衡而累及其他脏器，必将发生密切的因果关系。例如：慢性支气管炎-阻塞性肺气肿-肺心病。又，继发症除原发病可出现，其他兼症也能发生。

————刘桂蕊

摘要：目的研究槲皮素对 SW480 结肠癌细胞生长增殖及蛋白表达的影响。方法体外培养人结肠癌SW480 细胞后，采用人工重组基膜技术监测槲皮素对肿瘤细胞体外侵袭能力和运动活性的作用。将培养成功的细胞分为空白组和其余5个不同浓度(10、20、40、80、160 mg/L)的槲皮素作用组，观察干预结果，检测人结肠癌 SW480 细胞的增殖抑制率，选择最佳作用浓度；并通过免疫印迹法检测人结肠癌SW480内增殖细胞核抗原(PCNA)、Ki67的表达情况。结果结肠癌 SW480 细胞经槲皮素处理后，体外侵袭、运动能力呈剂量依赖性下降(P< 0.05)；槲皮素能显著抑制结肠癌SW480细胞的增殖，浓度为10、20、40、80、160 μmol/L的槲皮素作用于结肠癌 SW480 细胞的增殖抑制率分别为(4.1±1.2)%、(13.9±1.5)%、(38.8±2.2)%、(41.5±2.6)%、(45.3±2.6)%，与空白组对照相比差异有统计学意义(P<0.05)；干预的结肠癌SW480 细胞内 Ki67和PCNA的表达均呈下调表现(P<0.05)。结论槲皮素可呈浓度和时间依赖性地抑制结肠癌SW480细胞的增殖，对人结肠癌 SW480 细胞的生长有抑制作用，并能诱导其凋亡。

关键词：结肠癌；槲皮素；SW480；蛋白表达

Influence of Quercetin on the Proliferation and Protein Expression of SW480 Colon Cancer CellWANGFen,XIONGLing. (DepartmentofGastroenterology,ShiyanPeople′sHospitalAffiliatedtoHubeiMedicalCollege,Shiyan442000,China)

Abstract:ObjectiveTo study the influence of quercetin on the proliferation and protein expression SW480 colon cancer cell.MethodsHuman SW480 colon cancer cells were cultured in vitro,then artificial recombination of the basement membrane was adopted to observe quercetin effect on cell invasion and motor activity.The successfully cultured cells were divided into blank group and the rest into five quercetin groups of different concentrations of quercetin (10，20，40，80，160 mg/L)，then human colon cancer SW480 cells proliferation inhibition rates were tested,based on which the best concentration was cosen; Western blot method was used to detect the expression of cell nucleus antigen (PCNA and Ki67) in human SW480 colon cancer.ResultsAfter treatment by quercetin,the in vitro invasion,motor ability of SW480 colon cancer cells presented dose-dependent decline(P<0.05);different concentrations(10，20，40，80，160 μmol/L) of quercetin and its proliferation inhibition rates were (4.1±1.2)%,(13.9±1.5)%,(38.8±2.2)%,(41.5±2.6)%,(45.3±2.6)%,the differences from the blank control were statistically significant(P<0.05); the expression of Ki67 and PCNA in SW480 colon cancer cells after intervention showed down trend(P<0.05).ConclusionQuercetin can inhibit the proliferation of SW480 colon cancer cells in a concentration and time dependent way,which has inhibitory effect on the growth of human SW480 colon cancer cells,and can induce its apoptosis.

Key words:Colon cancer； Quercetin； SW480； Protein expression

收稿日期：2014-12-08修回日期：2015-04-14编辑：相丹峰

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.16.046

中图分类号:R979.1; Q279

文献标识码:A

文章编号：1006-2084(2015)16-3011-03