阿司匹林抑制去势大鼠IL-1，IL-6，TNF- 和M-CSF的表达及其防治绝经后骨质疏松作用的研究

杨 超，曾艳平，杨 桐，覃君慧，李海勋，桑宏勋

（1．中国人民解放军第四军医大学西京医院，陕西 西安 710032；

2．中国人民解放军第四军医大学基础部病理学与病理生理学教研室，陕西 西安 710032）

阿司匹林抑制去势大鼠IL-1，IL-6，TNF- 和M-CSF的表达及其防治绝经后骨质疏松作用的研究

杨 超1，曾艳平1，杨 桐2，覃君慧2，李海勋1，桑宏勋1

（1．中国人民解放军第四军医大学西京医院，陕西 西安 710032；

2．中国人民解放军第四军医大学基础部病理学与病理生理学教研室，陕西 西安 710032）

目的探讨阿司匹林对去卵巢骨质疏松模型小鼠体内白细胞介素-1(IL-1)、IL-6、肿瘤坏死因子- （TNF- ）及巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）表达的影响，以及其防治骨质疏松的作用。方法选取Sprague-Dawley大鼠60只，随机分为对照组（10只）和去卵巢模型组（50只），术后1周去卵巢模型组大鼠再随机分为骨质疏松组，其中，A组（0．25 mmol／L阿司匹林）、B组（0．5 mmol／L）、C组（1．0 mmol／L）和D组（1．5 mmol／L），各10只。检测各组血清和骨组织IL-1，IL-6，TNF- 和M-CSF水平，同时采用Micro-CT对骨小梁微观三维形态结构进行分析。结果骨质疏松组血清IL-1，IL-6，TNF- ，M-CSF分别为（80．15±7．18）pg／mL、（82．16± 6．63）pg／mL、（30．21±4．73）pg／mL和（11．42±4．25）pg／mL，均明显高于对照组（P＜0．05）。A，B，C，D组中，D组 IL-1，IL-6，TNF- 和 M-CSF水平最低（P＜0．05）。骨质疏松组骨组织 IL-1，IL-6，TNF- 和 M-CSF分别为（71．24±8．10）pg／mL、（78．02±5．15）pg／mL、（26．92±3．23）pg／mL和（10．22±3．15）pg／mL，均明显高于对照组（P＜0．05）；A，B，C，D组中，D组 IL-1，IL-6，TNF- 和M-CSF水平最低（P＜0．05）。Micro-CT检测结果表明，阿司匹林治疗组腰椎椎体骨小梁厚度、骨小梁数量及骨密度均显著高于骨质疏松组。结论阿司匹林能抑制去势大鼠骨流失，这可能与阿司匹林抑制大鼠血清和骨组织IL-1，IL-6，TNF-和M-CSF的表达有关，从而使破骨活动减弱的作用。

阿司匹林；细胞因子；骨质疏松；大鼠

骨质疏松是中老年人群高发疾病，患者单位体积内骨组织量显著低于正常水平，并因此出现疼痛、驼背、身高降低、骨折等症状[1]。临床尚未明确其发病机制，但分析可能与骨微环境改变有关。白细胞介素 -1(IL-1)、IL-6、肿瘤坏死因子 -α（TNF-α）及巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）是骨微环境中的重要功能因子，对骨代谢、骨改建活动存在重要影响[2]。阿司匹林是骨质疏松常用治疗药物，笔者研究了其对去卵巢骨质疏松模型小鼠体内IL-1，IL-6，TNF-α及M-CSF表达的影响，以及其防治骨质疏松的作用，现报道如下。

1 材料与方法

1．1 试验方法

动物及分组：选取Sprague-Dawley大鼠60只，6月龄，清洁级，体重240～330 g，由第四军医大学实验动物中心提供。将所有SD大鼠随机分为对照组（Sham组，10只）和去卵巢模型组（50只），其中去卵巢模型组大鼠术后1周再随机分为骨质疏松组(OVX组)，按给予阿司匹林剂量不同分为 A，B，C，D组(给药剂量分别为0．25，0．50，1．00，1．50 mmol／L），各10只。

造模方法：给予大鼠戊巴比妥麻醉后，常规腹部消毒，腹侧入路打开腹腔，对照组大鼠切除腹腔少许脂肪组织后逐步缝合；骨质疏松组大鼠切除双侧卵巢后逐步缝合。术后两组大鼠给予常规抗生素治疗，同样喂食进水。

干预方法：骨质疏松组(DVX组)大鼠中，A组给予0．25 mmol／L阿司匹林片（阿斯利康制药有限公司，国药准字H32026200，规格为每片0．3 g）+葡萄糖溶液10 mL灌胃治疗，B组给予0．50 mmol／L，C组给予1．00 mmol／L，D组给予1．50 mmol／L。

血清 IL-1，IL-6，TNF-α和M-CSF检测：治疗12周后，取大鼠股动脉血2 mL，2 000 r／min离心，收集血清，选用放射免疫（RIA）法检测血清IL-1及IL-6，选用双抗夹心酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清TNF-α和M-CSF，试剂盒均由北京冬歌博业生物科技有限公司生产，操作严格按照试剂盒说明书进行。

骨组织IL-1，IL-6，TNF-α和M-CSF检测：取血后处死大鼠，无菌条件下取出双侧侧股骨下端，多聚甲醛固定，置4℃温箱内保存。取部分骨样本，EDTA脱钙15 d，石蜡包埋，连续切片，选用卵白素-生物素-酶复合物染色法(ABC法)进行免疫组织化学染色，分步选用兔抗小鼠 IL-1，IL-6，TNF-α和 M-CSF多克隆抗体进行一抗，洗涤，山羊抗兔IgG二抗，洗涤，BAD染色，光镜下预读结果。

骨小梁微观三维形态结构 Micro-CT分析：取下 L4椎体节段，切除肌肉、韧带，仅保留椎体骨质部分。每组动物的10个椎体标本放入Micro-CT(美国GE公司）样本杯中，在相同条件下进行三维CT重建，评价骨小梁改建情况。分析指标包括骨体积分数(BV／TV)、骨表面积体积比（BS／BV）、骨小梁厚度（Tb．Th)、骨小梁数量（Tb．N）、骨小梁分离度 (Tb．Sp)及Micro-CT总体骨密度值（BMD)。

1．3 统计学处理

2 结果

结果见表1至表3和图1。

表1 各组血清IL-1，IL-6，TNF- 和M-CSF水平比较（，pg／mL)

表1 各组血清IL-1，IL-6，TNF- 和M-CSF水平比较（，pg／mL)

注：与对照组比较， P＜0．05；与OVX组比较，＃P＜0．05。表2同。

组别Sham组OVX组A组B组C组D组F值P IL-1 20．17±2．86 80．15±7．18 78．27±6．83 65．37±8．30 57．22±7．48 23．22±3．16＃57．281＜0．05 IL-6 22．14±3．27 82．16±6．63 77．12±7．49 72．36±6．91 62．07±8．04 31．29±7．18＃32．173＜0．05 TNF-17．87±2．12 30．21±4．73 28．13±2．41 24．11±3．02 23．17±3．01 19．91±2．17＃11．273＜0．05 M-CSF 1．82±0．93 11．42±4．25 9．48±3．12 7．33±2．10 5．22±1．14 2．32±0．98＃13．362＜0．05

表2 各组骨组织IL-1，IL-6，TNF- 和M-CSF水平比较（，pg／mL，n=10)

表2 各组骨组织IL-1，IL-6，TNF- 和M-CSF水平比较（，pg／mL，n=10)

组别Sham组OVX组A组B组C组D组F值P IL-1 18．13±2．24 71．24±8．10 63．21±7．01 53．11±6．88 35．22±6．17 21．13±3．02＃21．047＜0．05 IL-6 19．92±2．51 78．02±5．15 65．22±6．81 52．05±7．11 43．20±7．06 27．09±6．11＃35．091＜0．05 TNF-13．28±1．87 26．92±3．23 21．14±2．90 19．02±2．99 17．14±2．15 15．24±1．83＃12．042＜0．05 M-CSF 1．73±0．85 10．22±3．15 8．46±2．03 6．81±1．92 4．22±1．02 2．01±0．14＃9．202＜0．05

表3 各组灌胃3个月时Micro-CT结果比较（，n=10)

表3 各组灌胃3个月时Micro-CT结果比较（，n=10)

注：与OVX组比较，aP＜0．05。

图1 Micro-CT检测结果

3 讨论

绝经是骨质疏松的重要病因，雌激素水平下降诱使骨吸收与骨形成平衡失调，吸收大于形成，进而出现骨量降低，骨组织微结构退行性变，并发展为骨质疏松[3]。双侧卵巢切除是经典的绝经后骨质疏松造模方案，与绝经后骨质疏松具有极高相似度。本研究中，选取双侧卵巢切除大鼠进行绝经后骨质疏松大鼠造模，并对造模大鼠进行了不同剂量阿司匹林给药治疗。造模12周后，大鼠全身骨骼密度显著下降，骨皮质变薄，髓腔扩大，破骨细胞数目显著增多，而成骨细胞显著减少，呈明显骨吸收、骨形成失衡状态，提示造模成功。

M-CSF是一种二聚体糖蛋白，主要分布于骨髓腔内，对单核细胞分化、增殖以及活性维持具有重要作用[4]。其具有促骨吸收的功能，可与RANKL直接作用于破骨前体细胞的表达[5]。TNF-α是细胞凋亡因子，对骨吸收具有极强的诱导作用，可直接作用于破骨细胞的早期分化和成熟，还可介导基质细胞及成骨细胞合成破骨细胞分化需求的下游因子[6]。此外，TNF-α还可抑制成骨细胞生成，同时降低骨基质钙化，最终诱使骨形成及骨吸收失衡。IL-1及IL-6是骨代谢中的重要参与因子，均对骨吸收具有较强刺激作用，可直接或间接作用破骨细胞生成，增强骨组织骨吸收能力[7]。已有研究显示，绝经后人体雌激素量大幅降低，诱使IL-6基因转录、IL-1及 TNF-α启动子拮抗能力降低，IL-1及TNF-α可作为“上游”因子共同促进“下游”细胞因子的合成，包括IL-6及M-CSF等，最终诱使破骨细胞大量生成，导致骨吸收、骨形成失衡，并诱发骨质疏松[8]。破骨细胞是一种骨组织成分，具有骨吸收功能，其功能与成骨细胞对应，二者协同在骨骼形成、发育过程中扮演着重要角色[9]。

本研究结果显示，骨质疏松组大鼠血清及骨组织IL-1，IL-6，TNF-α，M-CSF水平明显高于对照组，提示骨质疏松组存在明显骨吸收情况，大鼠骨质疏松症状明显。不同剂量阿司匹林干预治疗后，D组大鼠血清及骨组织上述指标表达水平降低最明显，表明高剂量阿司匹林可有效抑制IL-1，IL-6，TNF-α，M-CSF表达，并以此降低大鼠骨吸收状态；其中1．5 mmol／L给药时，阿司匹林药物代谢动力学效果最佳。本研究采用Micro-CT对椎体的松质骨进行了重建分析，直接观察松质骨骨小梁形态、结构及三维构筑，并测量骨小梁的立体测量学的参数。结果表明，阿司匹林组灌胃治疗3个月后松质骨骨小梁数量、连接率及粗细程度均明显高于OVX组，且D组与Sham组无显著性差异。阿司匹林是临床常用药物，具有多种生物学效用，如抑制环氧化酶(COX)-1及COX-2活性等。体外试验表明，阿司匹林可有效抑制破骨前体细胞的分化、成熟，进而改善骨吸收与骨形成失衡状态，缓解骨组织退行性病变[10]。

综上所述，阿司匹林能抑制去卵巢骨质疏松模型小鼠血清和骨组织IL-1，IL-6，TNF-α和M-CSF表达，使破骨活动减弱，从而预防骨质疏松。此外，阿司匹林在骨质疏松治疗中存在剂量依赖性特征，但临床尚未达成系统的剂量标准，有待进一步研究。

[1]刘福志．雌激素联合抗骨质疏松药物治疗绝经后妇女骨质疏松40例[J]．中国药业，2013，22(23):83-84．

[2]冯 歆，李生强，赖玉琏，等．绝经后妇女膝关节骨性关节炎与骨质疏松症的相关性研究[J]．中国骨质疏松杂志，2014，20(4):357-359，445．

[3]赵为公，王 莹，邱希江，等．细菌脂多糖对破骨细胞发育的抑制作用研究[J]．中日友好医院学报，2013，27(1):30-33．

[4]Costa-Rodrigues J，Fernandes A，Fernandes MH．Spontaneous and induced osteoclastogenic behaviour of human peripheral blood mononuclear cells and their CD14(+)and CD14(-)cell fractions[J]．Cell Proliferation，2011，44(5):1 166-1 168．

[5]董 伟，冯晓洁，梁永强，等．双膦酸盐对破骨细胞分化中组织蛋白酶K及骨吸收功能的影响[J]．中国组织工程研究，2014，18(33): 5 293-5 298．

[6]张 伟，刘 媛，白 力，等．脂肪间充质干细胞对去卵巢骨质疏松大鼠治疗作用的实验研究[J]．中华风湿病学杂志，2013，17(4): 236-239．

[7]梁文娜，李西海，李灿东，等．骨免疫与绝经后骨质疏松妇女骨重建失衡[J]．国际骨科学杂志，2012，33(2):103-105．

[8]易伟莲，廖德权，林柏云，等．绝经后骨质疏松症患者性激素、细胞因子及骨代谢指标的变化及关系[J]．检验医学，2012，27(4):296-298．

[9]Fong D，Bisson M，Laberge G，et al．Bone morphogenetic protein-9 activates Smad and ERK pathways and supports human osteoclast function and survival in vitro[J]．Cellular Signalling，2013，25(4):717-728．

[10]许猛子，周君琳，陈智华，等．全身振动对绝经后骨质疏松症患者细胞因子的影响[J]．中华临床医师杂志：电子版，2012，6(19): 5 931-5 934．

Aspirin in Restraining IL-1,IL-6,TNF-α and M-CSF Expression and Its Effect in Preventing Post-Menopause Osteoporosis

Yang Chao1,Zeng Yanping1,Yang Tong2,Qin Junhui2,Li Haixun1,Sang Hongxun1
(1．Xijing Hospital,Fourth Millitary Medical University,Xi′an,Shaanxi,China 710032; 2．Pathology and Pathophysiology Teaching and Research Department,Fourth Millitary Medical University,Xi′an,Shaanxi,China 710032)

Objective To investigate the influence of aspirin on ovariectomized osteoporosis in mice interleukin-1(IL-1),interleukin-6 (IL-6),tumor necrosis factor(TNF-α)and macrophage colony-stimulating factor(M-CSF)expression and its role in prevention and treatment of osteoporosis．Methods 60 Sprague-Dawley rats were randomly divided into sham operation group(control group,10 rats)and ovariectomized model group (50 rats),and the ovariectomized model group were then randomly divided into the osteoporosis group,group A(given 0．25 mmol／L aspirin),group B(given 0．5 mmol／L aspirin),group C(given 1．0 mmol／L aspirin)and group D (given 1．5 mmol／L aspirin)at 1 week after operation,10 rats in each group．The serum and bone tissue IL-1,IL-6,TNF-α and M-CSF level were detected,while the scanning electron microscope was used to analyze every area of bone resorption．Results The IL-6,serum IL-1,TNF-α and M-CSF of the osteoporosis group were(80．15±7．18)pg／mL,(82．16 ±6．63)pg／mL,(30．21± 4．73)pg／mL and(11．42±4．25)pg／mL respectively,which were significantly higher than those of the control group(P＜0．05);in group A,B,C,D,the IL-1,IL-6,TNF-α and M-CSF levels of group D were the lowest(P＜0．05);the bone tissue IL-1,IL-6,TNF-α and M-CSF of the osteoporosis group were(71．24±8．10)pg／mL,(78．02 ±5．15)pg／mL,(26．92±3．23)pg／mL and (10．22±3．15)pg／mL respectively,which were significantly higher than those of the control group(P＜0．05);in group A,B,C,D,the IL-1,IL-6,TNF-α and M-CSF levels of group D were the lowest(P＜0．05);the micro -CT analysis showed that the vertebral trabecular thickness,trabecular bone volume and bone mineral density of the aspirin group were significantly higher than those of the OVX group．Conclusion Aspirin can inhibit the serum and bone tissue of ovariectomized osteoporosis mice model IL-1,IL-6,TNF-α and M-CSF expression,weaken the osteoclast activity,and to prevent osteoporosis．

aspirin;cell factor;osteoporosis;rat

R965；R971+.1

A

1006-4931(2015)21-0015-03

2015-05-27)

国家自然科学基金面上项目，项目编号：81270959。