一贯煎汤剂对肝纤维化大鼠肝脏I型胶原的影响

白辰 车念聪 刘文兰 赵晖 司远

肝纤维化(hepatic fibrosis，HF)是指以胶原纤维 为主的细胞外基质(extracellular matrix，ECM)在肝内大量沉积的病理过程［1］。与拮抗纤维化的西药相比，中药复方在对病人个体治疗方面具有一定优势。滋阴疏肝的时方一贯煎为临床常用治疗肝纤维化的方剂。本课题组前期实验研究表明［2］，一贯煎汤剂能有效降低血清转氨酶含量，减轻肝脏炎症程度。本研究拟通过建立CCl4诱导的大鼠肝纤维化模型，观察经一贯煎汤剂干预后，肝组织细胞外I型胶原沉积情况的变化，探讨一贯煎汤剂对降解细胞外I型胶原沉积是否有促进作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物及试剂

选用健康Sprague-Dawley大鼠，雄性，体质量180～200 g，鼠龄8周，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，合格证号:SCXK(京)2012-0001，共28只，饲养在首都医科大学实验动物科学部SPF级动物室。

一贯煎:根据原方药物剂量和比例［3］，选取北京同仁堂药店的标准中药材北沙参9 g、麦冬9 g、当归9 g、生地黄20 g、枸杞子12 g、川楝子4.5 g，煎煮为汤剂。按照体表面积计算，大鼠每100 g体质量所需生药为0.65 g，将一贯煎汤剂按照100 g大鼠灌胃1mL的体积配成相应浓缩液备用。

CCl4(四氯化碳分析纯专用试剂，纯度≥99.5%，北京现代东方精细化学品有限公司，批号:20060132)，橄榄油(阿果萨特级初榨橄榄油，最大酸度0.4%，批号:14001952)，秋水仙碱(西双版纳版纳药业有限责任公司生产，批号:120412)，生理盐水(石家庄四药有限公司，批号:20729509)，蛋白定量试剂盒(北京蒂诺奥生物科技有限公司)，一抗:Anti-Collagen I antibody ab34710(美国 abcam)、蛋白质印迹法二抗:Dylight 800-goat anti-rabbit IgG(美国 Earthox LLC)，二抗:Polink-2 plus@Polymer HRP Detection System(北京中杉金桥生物技术有限公司，PV-9001)。

1.2 仪器设备

酶标仪(Bio-Rad，Model680，美国)垂直电泳槽(Bio-Rad，美国)，小型电泳仪(Bio-Rad，美国)，Odyssey双色红外荧光成像系统(Li-Cor，美国)，荧光显微镜(Nikon Eclipse 80i)，恒温箱(Sanyo)。

1.3 造模

适应性饲养1周后，随机分为正常组，模型组，西药组，中药组。除正常组外，其余3组大鼠腹腔注射50%CCl4橄榄油溶液(0.2 mL/100 g)，每周2次，共2周;随后腹腔注射0.1 mL/100 g的CCl4橄榄油溶液，每周 2次，共 2周;接着腹腔注射0.05 mL/100 g的CCl4橄榄油溶液，每周2次，共2周。正常组大鼠以同样方式等剂量腹腔注射橄榄油溶液。

1.4 治疗

从第7周开始，停止腹腔注射，中药组予一贯煎浓缩液1 mL/100 g灌胃，西药组给予秋水仙碱灌胃，0.25 mg/kg(相当于成人用量的 30 倍)［4］。正常组和模型组予等量生理盐水灌胃。每天1次，连续4周。

1.5 采集及处理样品

治疗4周后，所有大鼠以10%水合氯醛按0.35 mL/100 g剂量腹腔注射麻醉。取肝左叶同一部分，常规脱水、石蜡包埋，4 μm连续切片。常规脱蜡至水，自来水洗5分钟，蒸馏水洗5分钟。抗原修复后，滴入适当一抗(1∶800)，37度孵育90分钟，磷酸盐缓冲液(pH 7.2～7.6)洗3次，每次2分钟。滴入适当二抗，37℃孵育20分钟，pbs洗3次，每次3分钟，室温显色。苏木素轻度复染，脱水，透明，封片，光镜观察。采用NIS-Elements BR 3.2采集图像，进行积分光密度分析。每组随机选取3个样本，取肝右叶50～100 g，剪碎匀浆后蛋白定量，5%浓缩胶80 V电泳约30分钟，10%分离胶120 V电泳至溴酚蓝到底。60 mA冰浴过夜转膜，封闭后一抗(1∶10000)室温摇床孵育 1小时，洗膜后二抗(1∶10000)室温摇床孵育1小时，洗膜后扫描成像，采用Imagej2x分析蛋白电泳灰度值。

1.6 统计学处理

采用SPSS 19.0进行统计处理，各组计量数据均以均数±标准差(±s)表示，采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD检验。以P＜0.05视为差异具有统计学意义，P＜0.01视为差异具有显著的统计学意义。采用Origin 8绘制统计图。

2 结果

正常组大鼠肝组织仅在中央静脉及汇管区周围可见极少量I型胶原沉积。与正常组相比，模型组大鼠I型胶原蛋白表达增加，在肝组织中央静脉及汇管区周围、桥接结构中可见大量I型胶原沉积，且散见于小叶各处。与模型组相比，西药组与中药组I型胶原表达减少，肝组织细胞外I型胶原沉积明显减少，在中央静脉及汇管区周围有部分I型胶原沉积。见图1、图2、表1。

图1 各组大鼠肝组织I型胶原免疫组化染色(×400)

图2 各组大鼠肝组织I型胶原蛋白表达

表1 各组大鼠肝组织I型胶原情况(x±s)

3 讨论

一贯煎始载自清·魏玉璜所著《续名医类案》，由生地黄、沙参、当归、枸杞、麦冬、川楝子组成，功擅滋阴疏肝，临床常用于治疗肝肾阴虚、肝郁气滞所致胁痛、口干、腰膝酸软等症状。根据HF的临床表现和病症特点，中医学可参考“胁痛”、“肝积”“臌胀”“黄疸”等病证范畴。其病因多为饮食失节、情志失常、劳伤虚损、感染虫毒等，致湿热邪毒内蕴，伤阴耗气，痰凝血瘀，损伤肝络，发为此病［5］。因肝肾二脏母子相及，乙癸同源，故肝纤维化病变后期往往出现肝肾阴虚的证候［6-7］。一贯煎方中重用生地黄为君药，滋阴养血，补益肝肾;以沙参、当归、枸杞、麦冬4药共为臣药，滋阴柔肝;同时少佐川楝子疏肝泄热，诸药合用，既滋补肝肾之阴又疏理肝气，使肝阴得养，肝气得舒。

包括蛋白多糖、胶原蛋白和黏连蛋白［8］在内的ECM代谢紊乱会导致肝脏结构和功能出现异常，其中I型胶原蛋白变化幅度最大［9］，可作为肝脏内胶原代谢变化的参考。正常肝组织细胞外间质的I型胶原主要分布在汇管区和中央静脉周围，研究表明［10-11］，I型胶原由激活的肝星状细胞(hepatic stellate cell，HSC)合成及分泌，受基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)/金属蛋白酶抑制因子(tissue inhibitor of matrix metalloproteinases，TIMPs)调节。本实验结果表明，模型大鼠肝组织I型胶原蛋白表达增加，在肝组织细胞外沉积增多，反映出CCl4诱导大鼠肝纤维化过程中出现I型胶原代谢紊乱，过度沉积。经一贯煎汤剂治疗后，肝组织内沉积的I型胶原明显减少。前期研究表明，I型胶原减少的原因考虑与调节肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)信号通路凋亡细胞抑制剂(cellular inhibitors of apoptosis，cIAP1)蛋白［12］，促进骨髓间充质干细胞募集到肝脏［2］，调节MMP-1/TIMP-1有关。目前抗肝纤维化的现代药物研究主要集中于逆转纤维化的多种靶点，包括MMPs/TIMPs、TGF-β 细胞因子、Toll样受体(Toll-like receptor，TLR)4、内源性大麻素(endogenous cannabinoids，EC)及其受体、整合素αV、微小RNA-29在内的多种潜在靶点，大部分仍处于临床前研究阶段［13］，应用一贯煎汤剂等中药复方拮抗肝纤维化的研究可为肝纤维化的治疗提供新的思路。

本实验结果提示:一贯煎汤剂能降低I型胶原在肝细胞外的沉积;同时提示一贯煎疏肝理气的功用可能与其减少肝组织内I型胶原，进而改善脏器结构有关。本实验为阐释一贯煎对肝纤维化的拮抗作用提供了一定的数据支持，为临床合理应用一贯煎治疗相关疾病起到一定的指导作用。

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(本文编辑:董历华)