糖肾安对早期糖尿病大鼠耳廓及肾脏微循环血流量的影响*

石玉婷 周陈陈 王 镁 于世家

糖肾安对早期糖尿病大鼠耳廓及肾脏微循环血流量的影响*

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目的：应用激光散斑成像(LSI)技术观察中药复方糖肾安煎剂对早期糖尿病(DM)大鼠耳廓及肾脏血流量的影响。方法：30只SD大鼠，采用高糖高脂饮食喂饲4周并一次性腹腔注射小剂量链脲佐菌素(STZ，35mg/kg)建立DM大鼠模型，将成模的28只大鼠随机分为DM模型组(n=9)、西药治疗组(胰激肽原酶肠溶片治疗，n=9)和中药治疗组(糖肾安煎剂治疗，n=10)，另选10只SD大鼠作为正常对照组。药物治疗8周后，用moor FLPI-2 全景激光灌注成像仪监测各组大鼠耳廓及肾脏微循环血流量变化。结果：DM模型组大鼠耳廓及肾脏血流量为133.42±49.58LSPU和297.19±39.43LSPU，正常对照组为70.04±7.28LSPU和239.27±33.27LSPU；中药治疗组为 77.11±14.16LSPU和253.6±35.57LSPU，西药治疗组为82.71±14.03LSPU和248.96±39.26LSPU。DM模型组上述检测值均高于正常对照组(P<0.01)；中药治疗组和西药治疗组上述检测值均显著低于DM模型组(P<0.01)；中药治疗组、西药治疗组和正常对照组组间血流量差异无统计学意义(P>0.05)。结论：糖肾安煎剂能明显减轻早期DM大鼠微循环障碍引起的微血管血流量增加，其效果与胰激肽原酶相当。

糖肾安煎剂；胰激肽原酶肠溶片；激光散斑成像技术；微循环血流量；糖尿病大鼠

微循环是血液与组织细胞进行物质交换的场所,微循环障碍是糖尿病(DM)微血管并发症的共同通路,且出现较早,甚至在DM发病前的胰岛素抵抗期就已经存在,可能参与了DM的整个发展过程[1]。糖尿病肾病(DN)是DM常见的慢性微血管并发症之一，也是DM的主要死亡原因之一[2]。DN的早发现、早诊断和早治疗极为重要。组织血流量检测可直接反映其微循环，包括肾脏微血管血流灌注状态，为临床诊断和防治提供依据。激光散斑成像 (Laser Speckle Imaging， LSI)技术，如全景激光灌注成像仪可进行组织表面血流灌注监测,已被用于研究皮肤[3]、大脑皮层[4-5]、肝脏[6-7]、回肠[8]等组织器官的表层血流变化,但少有运用此技术观察肾脏表面微循环血流变化的相关报道。本实验应用该技术同时观察早期DM大鼠耳廓和肾脏微血管血流量及在中药糖肾安煎剂干预后的变化，探讨中药改善DM微循环障碍的有关机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级健康雄性SD大鼠40只，体重200±20g，由北京华阜康生物科技股份有限公司提供，动物合格证编号：SYXK(辽)2013-0009。

1.2 试剂和药品

链脲佐菌素(STZ，批号：S8050，美国Sigma公司)；胰激肽原酶肠溶片(怡开， 批号：140517，120U/片，常州千红生化制药股份有限公司)；糖肾安煎剂(由黄芪、茯苓、白术、丹参、黄精、山茱萸等组成)。

1.3 主要仪器

全景激光灌注成像仪(型号：moor FLPI-2，英国Moor仪器有限公司)；血糖仪及血糖试纸(德国拜耳拜安康系列)。

1.4 实验方法

1.4.1 动物造模与分组:40只大鼠适应性喂养1周后，按照体重随机分为正常对照组(n=10)，给予普通饲料喂养；余30只高糖高脂饲料 (按猪油10%、蔗糖20%、胆固醇2%、胆酸盐1%、普通饲料67%配比)喂养4周后禁食12h，一次性左侧腹腔注射小剂量STZ(35mg/kg)，72h后尾静脉取血测血糖(BG)，其值≥16.7mmol/L确认为造模成功[9](2只未成模，予以剔除)。28只成模大鼠随机分为DM模型组(n=9)、西药治疗组(n=9)、中药治疗组(n=10)。对照组注射等量柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。

1.4.2 给药:西药治疗组给予胰激肽原酶肠溶片混悬液(研末溶于生理盐水中，浓度11.2U/ml)，中药治疗组给予糖肾安煎剂18g生药/kg/天(根据成人等效药量及人与大鼠体表面积换算而得)浓缩成浓度5.4g/ml的煎剂，两组均按照6.7ml/kg/天灌胃。DM模型组、正常对照组大鼠给予等量生理盐水。各组连续灌胃8周。

1.5 血流量检测

药物干预8周后，各组大鼠以10%水合氯醛溶液(3ml/kg)腹腔注射麻醉。先背位固定，平展大鼠右侧耳背，将moor FLPI-2散斑血流实时成像系统的 CCD 相机置于垂直耳廓上方20-30cm处，调节焦距至图像显示清晰；设定仪器参数为高分辨率像素(752×580像素)模式，采集速度25帧/s，每秒获取一幅血流图，间隔时间为1s，曝光时间为20ms，每只大鼠连续采样10-20s，逐一存储。之后，腹部常规消毒，剖开腹腔，暴露右侧肾脏皮层表面，以同样方法获取肾脏血流图。

采用moor FLPI-2.Review V4.0软件分析各组散斑血流图，图中颜色表示瞬间血流量，大小依次为红色>黄色>绿色>蓝色。利用软件输出监测时间内每张图片的血流量(LSPU)。

1.6 统计学处理

2 结 果

2.1 各组大鼠耳廓微循环血流量

正常对照组大鼠耳廓血流图以黄色为主，DM模型组大鼠耳廓血流图以红色为主，即灌注量增加；西药治疗组、中药治疗组大鼠耳廓血流图中红色减少，黄色、蓝色增多，即灌注量下降。见图1。

定量分析表明，各组大鼠耳廓微循环血流量差异有统计学意义(F=9.529，P<0.01)； 与正常对照组比较，DM模型组显著升高(t=-4.019，P<0.01)；与DM模型组比较，西药治疗组、中药治疗组均显著降价(t=2.784，t=2.677，P<0.01)；西药治疗组、中药治疗组及正常对照组之间差异无统计学意义(F=2.655，P>0.05)。见表1。

表1 各组大鼠耳廓血流量比较

注：与正常对照组比较，1)P<0.01；与DM模型组比较，2)P<0.01

2.2 各组大鼠肾脏微循环血流量

正常对照组大鼠肾脏血流图以黄色为主；DM模型组大鼠肾脏血流图以红色为主，灌注量升高；西药治疗组、中药治疗组大鼠肾脏血流图以黄色为主，灌注量下降。见图2。

定量分析显示，各组大鼠肾脏微循环血流量差异有统计学意义(F=22.732，P<0.01)； 与正常对照组比较，DM模型组显著升高(t=-6.672，P<0.01)；与DM模型组比较，西药治疗组、中药治疗组均显著降低(t=7.956，t=2.931，P<0.01)；西药治疗组、中药治疗组及正常对照组之间差异无统计学意义(F=0.906，P>0.05)。见表2。

表2 各组大鼠肾脏血流量比较

注：与正常组比较，1)P<0.01；与模型组比较，2)P<0.01

[本文图1、图2见封2]

3 讨 论

微循环障碍包括三个方面:血流动力学异常、微血管病变和血液流变学改变。微循环障碍早期血流动力学异常可出现微血管血流量增加、压力增高等，属于微循环功能异常,一般是可逆性的[10]。因此，除综合治疗外，早期实施有效改善微循环策略成为DM微血管病变的治疗措施。

已有研究[11]证实,糖肾安煎剂可以有效地降低DM大鼠尿微量白蛋白(mALB)和血、尿转化生长因子β1(TGF-β1)水平，预防肾纤维化，减轻肾小球病理学改变。丹参具有降低血黏度、抗凝、抗血栓、促进纤溶、改善微循环等作用，其提取物丹参多酚酸盐能够提高DM患者体内抗氧化酶超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)等的活性水平[12]；丹参、黄芪及二者合用能够提高大鼠肾组织线粒体呼吸功能及肾脏组织内三磷酸腺苷(ATP)含量，改善DN大鼠的肾脏功能[13]。黄芪中的黄芪甲苷能使BG、mALB降低、肾脏肥大减轻、提高足细胞黏附分子的表达[14]，黄芪总皂苷能够抑制高糖诱导下的大鼠肾小球系膜细胞的过度增殖，下调一氧化氮合酶(NOS)表达，降低NO含量，保护肾脏[15]。山茱萸环烯醚萜总苷有明显降血糖作用，抑制氧化应激，对DN及DM血管并发症均有良好保护作用[16]。

胰激肽原酶属于丝氨酸蛋白水解酶，是人体激肽释放系统的重要组成部分，许琳[17]认为早期T2DM患者体内激肽释放酶活性受到明显抑制，难以发挥激肽系统固有的作用，因而早期、及时补充激肽释放酶，对恢复激肽系统的活性尤为重要。魏京霞[18]也指出，激肽原酶能够降解激肽原释放出激肽作用于微血管，使血管扩张，同时抑制基底膜细胞增生，防治其增厚，还能激活纤溶系统，抑制血小板聚集，预防肾毛细血管微血栓形成，从而部分纠正DM早期的血流动力学异常，改善微循环。

本文结果显示，与正常对照组比较，DM模型组大鼠耳廓及肾脏血流量显著升高，经西药和中药治疗8周后，其血流量显著降低，与正常对照组水平相近。表明DM大鼠微循环障碍的早期表现可能为血流量增加，中药复方糖肾安煎剂能明显减轻这种病理变化，其效果与胰激肽原酶相当。

本实验所用LSI技术直接地检测了大鼠耳廓与肾脏微循环血流，也间接反映了全身微循环状况，而且操作简便，分辨率高，成像速度快，无需注入造影剂便可得到实时的二维速度分布图，对判断病情、 观察疗效和研究循环系统疾病的发病机制等方面可能有积极作用。

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本文第一作者简介：

石玉婷(1989—)，女，汉族，硕士研究生，主要从事内分泌专业相关疾病的研究

1 喻秀兰.中医对糖尿病微循环障碍的认识和治疗[J].微循环学杂志，2013,23(2):5-6.

2 王维平，何 萍，姜 璐.来氟米特联合缬沙坦及胰激肽原酶治疗糖尿病肾病的疗效观察[J].中国中西医结合肾病杂志,2014,15(3):236-238.

3 Stanhewicz AE,Ferguson SB,Bruning RS,et al.Laser-speckle contrast imaging:a novel method for assessment of cutaneous blood flow in perniosis[J].JAMA Dermatol,2014,150(6):658-660.

4 Dufour S,Atchia Y,Gad R,et al.Evaluation of lasers peckle contrast imaging as an intrinsic method to monitor blood brain barrier integrity[J].Biomed Opt Express,2013,4(10):1 856-1 875.

5 闵 喆,李昌盛,方 瑜,等. 激光散斑成像技术在大鼠大脑中动脉栓塞模型侧枝循环观测中的应用[J]. 神经损伤与功能重建,2014,9(3):191-194.

6 李崇辉,王洪东,葛新兰,等. 应用激光散斑对比成像技术监测大鼠肝脏缺血再灌注前后的微循环血流变化[J]. 微循环学杂志,2013,23(4):16-19.

7 Wu Y,Ren J,Zhou B,et al.Laser speckle contrast imaging for measurement of hepatic microcirculation during the sepsis:a novel tool for early detection of microcirculation dysfunction[J].Microvasc Res,2015,97(10):137-146.

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9 刘 毅，王字保.糖尿病肾病动物模型的研究进展[J].中国实验动物学报,2006,14(1)：67-70.

10 祝继英,王明贤,秦佰焰，等.肾炎康复片联合阿魏酸哌嗪片对糖尿病肾病微循环障碍的影响[J].中国实验方剂学杂志,2014,20(15):212-216.

11 王 镁,吴兆利,郑曙琴,等.糖尿病大鼠血、尿TGF-β1的相关性及糖肾安对其表达的影响[J]. 中医药信息,2012,29(1):60-62.

12 姚慧娟,姚慧敏,李莉霞,等.丹参多酚酸盐对2型糖尿病患者胰岛β细胞功能和血清抗氧化酶活性水平的影响[J].中国医药导报,2015,12(10):135-138.

13 王晓华,何杏容,华红艳,等.丹参联合黄芪对糖尿病肾病大鼠肾脏线粒体呼吸及能量代谢的影响[J]. 临床与病理杂志,2015,35(2):243-247.

14 郭维文,黎 帅,陈玲玲,等. 黄芪甲苷对糖尿病肾病大鼠肾脏的保护作用及其机制[J]. 中国病理生理杂志,2014,30(2):351-354.

15 陈 肖,王栋栋,魏 彤,等.黄芪总皂苷对高糖诱导的大鼠肾小球系膜细胞增殖及iNOS/NO表达的影响[J].中国生化药物杂志,2015,35(1):49-51.

16 李观林.山茱萸中环烯醚萜苷类的研究进展[J].亚太传统医药,2014,10(18):48-49.

17 许 琳.前列地尔联合胰激肽原酶治疗糖尿病肾病的临床疗效观察[J].中外医学研究 ,2014,12(27)：33-34.

18 魏京霞.胰激肽原酶肠溶片联合贝那普利治疗糖尿病肾病70例[J].中国药业,2015,24(3)：67-68.

中国人群HCV精确基因分型和新亚型的鉴定

本刊编委，武汉大学人民医院检验医学中心童永清等于2015年在《Clinical Microbiology and Infection》( 2区，IF= 5.768)发表了题为“Accurate genotyping of hepatitis C virus through nucleotide sequencing and identification of new HCV subtypes in China population”的研究论文，主要内容如下：

1 研究背景和目的：丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白5B(NS5B)区域核苷酸测序是HCV基因分型的金标准。本文拟建立一种新的NS5B区域核苷酸测序方法，并对该方法能否增加HCV基因测序的准确性和灵敏度进行评估。

2 方法：从HCV数据库中提取HCV基因组序列，采用BLAST分析序列的相似性，利用Primer5.0等引物设计软件设计所有可能的PCR扩增引物，通过进化树分析所扩增片段的分型能力。利用设计的引物检测HCV感染人群，分析其对HCV的分型能力。

3 结果：比对HCV数据库中1 127株HCV基因组序列，设计获得8对新引物。通过对新引物扩增DNA序列测序，发现其可特异并准确地测定5个标准HCV亚型(1a、2a、3b、6a和1b)。并且这些新引物可从567份临床标本中检测出所有HCV亚型，而且灵敏度高。另外，新的引物从这些标本中鉴定出3种新的HCV亚型(1b-2a、1b-2k和6d-6k)。

4 结论：这些新引物扩增NS5B区域的能力优于既往设计的引物，可以更准确地鉴定HCV病毒株亚型，有助于临床诊断、临床治疗指导、临床患者管理和HCV流行病学研究。

The Effect of Tang Shenan Decoction on Microcirculation Blood Flow in Auricle and Kidney of Early Diabetic Rats

SHI Yu-ting1， ZHOU Chen-chen1， WANG Mei2，#， YU Shi-jia2

1Graduate Institute of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine, Shenyang 110847，China;2Department of Endocrinology, The Affiliated Hospital of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine,Shenyang 110032,China;#

Objective:To observe the effect of tang shenan decoction on microcirculation blood flow in early diabetic rat auricle and kidney by using laser speckle imaging (LSI) technology.Method:30 SD rats were choosen to establish the diabetic rats models by high-lipids and high-sucrose diets for 4thweek and then intraperitoneal injection of one-time (STZ,35mg/kg),and then they were randomly divided into DM model group(n=9), western medicine-treated group (n=9)and chinese medicine-treated group(n=10),another 10 SD rats were served as the control group.All groups were given relevant medicinal intragastrically. The changes of rats auricle and kidney microcirculation blood flow were detected by a Moor-full field laster perfusion imager (Moor-FLPI) at the end of 8thweek. Results:The rats aurical and kidney blood flow of DM model were 133.42±49.58LSPU and 297.19.85±39.43LSPU. The control group were 70.04±7.28LSPU and 239.27±33.27LSPU. Both chinese medicine-treated group 77.11±14.16LSPU,253.6±35.57 LSPU and western medicine-treated group 82.71±14.03LSPU,248.96±39.26 LSPU were obviously lower than the DM model group, and the differences were significant(P<0.01),but we found no statistical difference among chinese medicine-treated group、western medicine-treated group and the control group(P>0.05).Conclusion:Tang shenan decoction have the equivalent efficacy with pancreatic kininogenase in reducing the blood flow of rats aurical and kidney which was caused by early-stage diabetic.

Tang shenan decoction； Pancreatic kininogenase enteric-coated tablets；Laser speckle imaging technology；Microcirculatory blood flow；Diabetic rat

沈阳市科技局项目(F14-231-1-11)

1辽宁中医药大学研究生学院，沈阳 110847；2辽宁中医药大学附属医院内分泌科，沈阳 110032；#

，E-mail：wm896464@163.com

本文2015-05-12收到，2015-06-27修回

R587.2

A

1005-1740(2015)03-0005-04