高效液相色谱法测血清中25-羟维生素D3

刘怡欣，赛 娜，赵世晶，李紫薇，黄国伟（天津医科大学公共卫生学院营养与食品卫生学系，天津 300070）

论著

高效液相色谱法测血清中25-羟维生素D3

刘怡欣，赛 娜，赵世晶，李紫薇，黄国伟
（天津医科大学公共卫生学院营养与食品卫生学系，天津 300070）

目的：建立检测血清中25-羟维生素D3[25（OH）D3]的高效液相色谱分析方法。方法：样品用甲醇沉淀蛋白，以正己烷提取后，离心取上清液过膜。甲醇-水（95∶5）为流动相，选用Venusil MP-C18（250 mm×4.6 mm,5 μm）色谱柱进行色谱分离，流速为1.0 mL/min，紫外检测波长265 nm，柱温30℃。结果：25（OH）D3在线性范围4.00～160.00 μg/L内与其响应值线性关系良好（r= 0.999 9），4.00、8.00、16.00、80.00 μg/L的25（OH）D3的平均回收率分别为85.22%、92.50%、100.75%、109.50%，RSD分别为4.32%、2.91%、2.25%、1.78%（n=4），测健康成年人血清25（OH）D3浓度为（38.14±14.74）μg/L。结论：该方法准确可靠，可用于血清中25（OH）D3的检测。

高效液相色谱法；25-羟维生素D3；血清

维生素D是一种脂溶性维生素，也是一种类固醇衍生物，主要来源于食物及皮肤合成。近年来研究显示，维生素D不仅能够调节钙磷平衡和骨骼代谢，还具有调节免疫、抗肿瘤、调控细胞增殖、防治代谢综合征、抗炎、保护心血管健康等多种生物学功能[1]。临床和流行病学证据也表明，维生素D对胰岛具有保护作用，并且是维持正常的胰岛素分泌和糖耐量所必需的物质[2]。维生素D缺乏的状况在全球范围内普遍存在。按照国际上对维生素D状态评价的普遍标准[3]，全球已有50%的人口存在维生素D缺乏的风险[4]。因此，有必要探索建立一种可靠、高效的测定方法，为维生素D的检测、相关疾病的研究与诊断提供强有力的科学依据。目前临床上普遍接受维生素D的评价指标是25-羟维生素D3[25-hydroxyvitamin D，25（OH）D3]，因为它的生物半衰期是3周左右，较1，25-二羟维生素D3[1，25-dihydroxyvitamin D，1，25（OH）2D3]（半衰期4～6 h）更为稳定[5]。常用的测血液中25（OH）D3的方法有竞争蛋白结合法（CPBA）、放射免疫法（RIA）、ELISA、高效液相色谱法（HPLC）[6]等，本研究参考相关文献[7-8]，采用HPLC法建立血清25（OH）D3的检测方法，并应用于健康成年人的检测。

1 材料与方法

1.1 仪器和试剂 600E高效液相色谱仪（美国Waters公司）；BSA224S电子分析天平（北京赛多利斯科学仪器有限公司，d=0.1 mg）；Venusil MP-C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；QL-901漩涡混合器（江苏海门市麒麟医用仪器厂）；2-16PK型离心机（美国Sigma公司）；超纯水系统（Mili-Q integral 10,美国密理博公司）。

25（OH）D3对照品（美国Sigma公司，705888-1 MG），纯度＞98%（HPLC级）；人血清（天津市和平区健康教育指导中心）；甲醇、正己烷（天津博纳艾杰尔科技有限公司，色谱纯）；高纯氮气（天津赛米气体有限公司）。

1.2 研究对象的一般情况 收集2014年天津市和平区健康教育指导中心的健康体检者血清样本30例，男、女比例为1∶1，平均年龄（50.95±10.94）岁。所有研究对象均未患糖尿病、肥胖、甲状腺功能不全、肿瘤等疾病，近期无外伤、感染，且连续3个月没有服用维生素D及其衍生物和钙剂。研究对象均签署知情同意书。

1.3 方法

1.3.1 色谱条件与系统适用性试验 色谱柱：Venusil MP-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇-水（95∶5）溶液；流速：1.0 mL/min；柱温：30℃；紫外检测波长：265 nm；进样量：20 μL。

1.3.2 对照品溶液的制备 精密称取25（OH）D3对照品5 mg，置于10 mL量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，即为500 μg/mL对照品溶液，使用时用甲醇稀释。

1.3.3 血清样品处理 精密量取0.5 mL血清置于15 mL离心管中，加入0.8 mL甲醇，漩涡震荡2 min，加入4 mL正己烷，漩涡震荡2 min，5 000 r/min 4℃离心5 min，精密吸取上层清液于室温（25℃）氮气吹干，吹干后残渣立即用150 μL甲醇溶液复溶。

1.3.4 供试品溶液的制备 准确量取按照“1.3.3”项下处理的血清样本溶液150μL，用0.22μm的微孔滤膜过滤后，将液体注入样品瓶中，即得供试品溶液。1.3.5 阴性对照溶液的制备 准确量取0.5 mL空白血清，按照“1.3.3”及“1.3.4”项下的步骤，制备成空白对照溶液。

1.3.6 专属性试验 分别取对照品溶液、供试品溶液各20 μL，按“1.3.1”项下色谱条件进样测定。

1.3.7 线性关系考察 精密量取10 μL 500 μg/mL的对照品溶液，置于50 mL量瓶中，用甲醇稀释，制备成4.00、8.00、16.00、80.00、160.00 μg/L浓度梯度的系列对照溶液。分别按照“1.3.1”项下的色谱条件进样20 μL，进行测定。

1.3.8 精密度试验 （1）日内精密度：取25（OH）D3对照品溶液适量，按“1.3.1”项下的色谱条件连续进样测定5次，进样量20 μL，记录峰面积；（2）日间精密度：取25（OH）D3对照品溶液适量，按“1.3.1”项下的色谱条件分别于0、1、2、3、4 d进样测定，记录峰面积。

1.3.9 稳定性试验 （1）室温稳定性：取同一供试品溶液适量于室温下（25℃）避光放置，按“1.3.1”项下的色谱条件分别于制备后0、2、4、6 h进样20 μL测定，记录峰面积；（2）冷藏稳定性：取同一供试品溶液适量置于4℃条件下，按“1.3.1”项下的色谱条件分别于制备后0、1、2 d进样测定，记录峰面积；（3）冷冻稳定性：取同一供试品溶液适量置于冰冻条件下（-20℃），按“1.3.1”项下的色谱条件分别于制备后0、3、6、9 d进样测定，记录峰面积。

1.3.10 重复性试验 精密量取同一血清样品适量，共3份，分别按照“1.3.3”项下供试品制备方法制备供试品溶液，按照“1.3.1”项下的色谱条件各取20 μL进样测定，记录峰面积。

1.3.11 加样回收率试验 精密量取同一血清样品适量，共4份，分别加入浓度为4.00、8.00、16.00、80.00 μg/L的25（OH）D3对照品溶液，按照“1.3.3”项下供试品制备方法制备供试品溶液，按照“1.3.1”项下的色谱条件各取20 μL进样测定，记录峰面积，计算方法的加样回收率。

1.3.12 样品含量测定 取30例健康成年人的血清样本，分别按照“1.3.3”项下供试品制备方法制备供试品溶液，按照“1.3.1”项下的色谱条件各取20 μL进样测定，记录峰面积，计算25（OH）D3的浓度。

1.4 统计学方法 采用SPSS16.0统计软件对结果进行统计分析。

2 结果

2.1 专属性试验结果 按照HPLC测定方法及相应浓度，绘制色谱图，见图1。由图可知该液相条件下，25（OH）D3的保留时间为12.55 min，出峰时间适宜，峰形良好，且能与其他峰有效地分离。

图1 25（OH）D3对照品（a）、供试品（b）和阴性对照品溶液（c）的HPLC色谱图

2.2 线性关系考察结果 以25（OH）D3浓度（X）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标作线性回归，得线性方程为：Y=1 900.7X+67.086（r=0.999 9，n=5）。结果表明25（OH）D3在4.00～160.00 μg/L浓度范围内与峰面积分值线性关系良好，最低定量限（LOQ）为4.00 μg/L。

2.3 精密度试验结果 血清25（OH）D3的日内精密度RSD为2.00%～4.62%，日间精密度RSD为2.68%～5.15%，表明该方法的重现性良好，符合要求。

2.4 稳定性试验结果 （1）血清25(OH)D3室温稳定性RSD为3.60%，表明血清样品在室温下6 h内稳定性良好；（2）血清25（OH）D3冷藏定性RSD为3.10%，表明血清样品在4℃下3 d内稳定性良好；（3）血清25（OH）D3冷冻稳定性RSD为2.92%，表明血清样品在-20℃下9 d内稳定性良好。

2.5 重复性试验结果 25（OH）D3的血清样品溶液重复性RSD=0.93%（n=3），表明本方法重复性良好。2.6 加样回收率试验结果 测定结果见表1。

表1 25（OH）D3的平均加样回收率（n=4）

2.7 样品含量测定结果 30例健康成年人血清25 （OH）D3平均浓度为（38.14±14.74）μg/L，RSD小于4%。

3 讨论

3.1 测定方法的评价 CPBA、RIA法使用放射性核素、分析费时、不同试剂盒间存在差异，且抗体之间的交叉反应会导致免疫分析方法的特异性不足，而HPLC法不存在上述缺点，HPLC仪器复杂，但分析操作省时、省力，具有分离效能高、分析速度快、重复性好、节约成本、精确度高、可自动化等优点[9]。3.2 色谱条件的选择 （1）测定波长的选择：对25 （OH）D3标准溶液进行波长扫描，结果表明其最大吸收在波长265 nm处，故选择在此波长下进行25 （OH）D3的测定，避免了血清内源性杂质的干扰，提高了灵敏度。（2）色谱条件的确定：有文献采用乙腈作为流动相[10]，考虑到乙腈毒性较大、价格昂贵，故改用甲醇-水为流动相。经多次试验，最终将流动相比例调为甲醇-水（95∶5），流速为1.0 mL/min，在此条件下，25（OH）D3出峰时间适宜，峰形良好，待测物能与其他杂质较好地分离。（3）样品提取溶剂的选择：曾分别用氯仿、正己烷提取血清中25（OH）D3，氯仿作为提取剂时，氮气吹干的时间较正己烷长，根据提取效果，最后确定用正己烷进行液-液萃取，血中杂质不影响被测组分的检出，同时获得了较高且稳定的提取回收率。

3.3 检测方法的应用 本研究的临床应用结果显示，健康成年人的血清25（OH）D3的均值为（38.14± 14.74）μg/L。这与相关文献[11]报道基本一致，表明本试验方法的准确性良好。

综上所述，本试验建立并验证了血清中25 （OH）D3的高效液相色谱测定方法，总体来说回收率高，精密度、准确性较好，可应用于未来血清25 （OH）D3的检测。

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（2014－11－14收稿）

R15

A

1006-8147（2015）04-0348-03

刘怡欣（1988-），女，硕士在读，研究方向：营养与慢性病防治；通信作者：黄国伟，E-mail:huangguowei@tijmu.edu.cn。